暗紋東方鲀線(xiàn)粒體基因組全序列和CD8基因的克隆與表達(dá)特征分析.pdf

1、暗紋東方鲀(Takifugu fasciatus)是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的魚(yú)類(lèi)，其產(chǎn)量居鲀形目魚(yú)類(lèi)之前列，并能進(jìn)行人工養(yǎng)殖。
　　 鲀形目魚(yú)類(lèi)的分子系統(tǒng)學(xué)研究是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)，從種級(jí)至目各分類(lèi)階元的系統(tǒng)發(fā)育研究中，多數(shù)是部分或全部用到了線(xiàn)粒體基因組序列。為此，本研究通過(guò)設(shè)計(jì)13對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，首次獲得了暗紋東方鲀線(xiàn)粒體基因組DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)全序列，并結(jié)合東方鲀屬其它種類(lèi)的mtDN

2、A進(jìn)行了線(xiàn)粒體全基因組水平的系統(tǒng)發(fā)育分析。
　　 暗紋東方鲀mtDNA基因組序列全長(zhǎng)16444bp，A+T含量為55.8％，其mtDNA由22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因、13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和1段819 bp非編碼的控制區(qū)(D-loop)所組成。蛋白質(zhì)基因除COI和ND6的起始密碼子為GTG、CCT以外，均為典型的起始密碼子ATG。ND1、ATPase8、COIII、ND4L、ND5、Cyt b使用典型的終止密碼子TAA，

3、其他的使用不完全終止密碼子。除ND6和tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNAcys、tRNATyr、tRNAser、tRNAGlu、tRNAPro在L-鏈上編碼之外，其余基因均在H-鏈編碼?；蚺帕许樞蚺c已測(cè)定的鲀類(lèi)一致。tRNA基因核苷酸長(zhǎng)度為64-73nt，預(yù)測(cè)了22個(gè)tRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)，大多呈較為典型的三葉草狀?；诰€(xiàn)粒體基因組全序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)表明，暗紋東方鲀和紅鰭東方鲀(T.rubripes)、中華東方鲀

4、(T.chinensis)聚成一個(gè)姊妹群。研究表明，暗紋東方鲀線(xiàn)粒體基因組的組成、順序、編碼鏈的選擇、tRNA的結(jié)構(gòu)以及GC和AT偏斜等，都與典型的脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體相同，亦未發(fā)現(xiàn)重排和假基因?；跂|方鲀屬魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體全序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)與形態(tài)學(xué)分類(lèi)的階元關(guān)系比較吻合，結(jié)果再次支持東方鲀屬魚(yú)類(lèi)為一個(gè)單系類(lèi)群。研究將為暗紋東方鲀線(xiàn)粒體基因組的遺傳特點(diǎn)和物種多樣性的分析提供分子依據(jù)。
　　 在暗紋東方鲀的放養(yǎng)過(guò)程中，由于集約化養(yǎng)殖的現(xiàn)狀會(huì)導(dǎo)

5、致魚(yú)體經(jīng)常受到細(xì)菌、寄生蟲(chóng)以及病毒的侵染而導(dǎo)致免疫能力下降。魚(yú)類(lèi)分子免疫學(xué)尚處于起始階段。在免疫應(yīng)答研究中，相對(duì)于體液免疫相關(guān)分子，細(xì)胞免疫相關(guān)分子的研究更少。因此，本文選取了細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)表面輔助受體CD8分子進(jìn)行研究。CD8是T細(xì)胞表面的雙鏈糖蛋白，存在CD8α和CD8β兩種亞基形式，是與Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合體( MHC I)結(jié)合，是T細(xì)胞表面受體(TCR)的共受體，也是T淋巴細(xì)胞表面的重要標(biāo)志物，作為粘附分子和輔助受體廣

6、泛參與TCR對(duì)MHC I分子遞呈抗原的識(shí)別和信號(hào)傳遞過(guò)程。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，克隆和分析暗紋東方鲀CD8分子兩亞基CD8α和CD8β，運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time RT-PCR)、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry, IHC)、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)等方法探討CD8在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的基因表達(dá)特征。
　　 克隆獲得的暗紋東方鲀CD8α cDNA序列為153

7、3 bp，包含一個(gè)657 bp的開(kāi)放讀碼框(ORF)，編碼218個(gè)氨基酸；其對(duì)應(yīng)的基因組序列為1533 bp，包含5個(gè)內(nèi)含子和6個(gè)外顯子。CD8β cDNA序列長(zhǎng)1063 bp，ORF長(zhǎng)為654bp，編碼217個(gè)氨基酸，其相應(yīng)的基因組序列長(zhǎng)2639 bp，包含6個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。生物信息學(xué)表明，未成熟的CD8α和CD8β分子多肽序列都由信號(hào)肽、胞外可變區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)五部分組成。在胞外區(qū)可變區(qū)和鉸鏈區(qū)部分各有兩個(gè)高度保守的

8、半胱氨酸殘基，參與鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵的形成。氨基酸序列多重比對(duì)表明，暗紋東方鲀與其他魚(yú)類(lèi)的CD8蛋白在結(jié)構(gòu)上是相似的，進(jìn)化上和鱸形目、鰈形目的魚(yú)類(lèi)關(guān)系較近。RT-PCR結(jié)果顯示，CD8α和CD8β mRNA在暗紋東方鲀組織中的表達(dá)量基本上是相一致的，各組織中都有表達(dá)但存在差異性。CD8在胸腺中呈現(xiàn)最高的表達(dá)水平，在其他組織器官中也有一定量的表達(dá)，而在肝臟中的表達(dá)量低弱。IHC和FCM研究結(jié)果表明，CD8在暗紋東方鲀的組織器官均呈現(xiàn)免疫細(xì)胞