豬CD3ε、CD4和CD8α分子的cDNA克隆、序列分析與原核表達(dá).pdf

1、CD3、CD4和CD8分子是表達(dá)于哺乳動物T細(xì)胞和部分胸腺細(xì)胞表面的共受體與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,它們共同參與TCR介導(dǎo)的T細(xì)胞活化和胸腺細(xì)胞分化過程.該研究應(yīng)用RT-PCR和RACER技術(shù)從豬的外周血淋巴細(xì)胞和胸腺細(xì)胞總RNA中,分別擴(kuò)增克隆了豬CD3ε、CD4和CD8α分子的全長cDNA序列,對豬CD3ε、CD4和CD8α分子在cDNA序列及其推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行了分子信息學(xué)分析.采用融合蛋白原核表達(dá)策略,成功地在大腸桿菌中表達(dá)了豬CD3ε、

2、CD4和CD8α分子的胞外區(qū)肽段.1、序列分析結(jié)果表明,豬CD3εcDNA序列長1241nt,其中5'非翻譯區(qū)80nt,3'非翻譯區(qū)570nt,開放閱讀框591nt,該開放閱讀框編碼196個氨基酸的豬CD3ε前體蛋白(無糖基化位點).推導(dǎo)氨基酸序列的分析結(jié)果表明,在豬ε蛋白的胞外區(qū)Cys<'49>、Cys<'91>、Cys<'108>和Cys<'111>為保守性氨基酸殘基;在豬CD3ε蛋白胞漿區(qū)中,存在免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)

3、、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)潴留基序和SH3結(jié)合基序,這些基序與T細(xì)胞的活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和TCR-CD3復(fù)合體裝配相關(guān),其中ITAM基序含有二個SH2結(jié)合基序的二個潛在酪氨酸磷酸化位點Tyr<'177>和Tyr<'188>.氨基酸序列比較結(jié)果表明,豬與人、鼠、狗、牛和綿間CD3ε蛋白的氨基酸同源性分別為61.2﹪、58.7﹪、58.7﹪、65.1﹪和65.6﹪.2、對豬CD4基因克隆和序列分析的結(jié)果表明,在豬的胸腺細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞中存在兩種方式剪接的CD4

4、 mRNA轉(zhuǎn)錄本,其中一種mRNA轉(zhuǎn)錄本缺失編碼40個氨基酸殘基(包含跨膜區(qū)氨基酸)的120nt連續(xù)序列,推測該轉(zhuǎn)錄本編碼豬分泌型CD4分子;豬CD4全長cDNA序列為2715mt,其中5'非翻譯區(qū)158nt,3'非翻譯區(qū)1183nt,開放閱讀框1374nt,該開放閱讀框編碼457個氨基酸的豬CD4前體蛋白(含4個N-糖基化位點).推導(dǎo)氨基酸序列分析結(jié)果表明,在豬CD4分子中7個Cys殘基(Cys<'43>、Cys<'122>、Cys<

5、'327>、Cys<'418>、Cys<'421>、Cys<'444>和Cys<'446>)和2個Ser殘基(Ser<'432>和Ser<'439>)在哺乳動物種間保守;在豬CD4分子胞漿區(qū),存在高度保守的Src家族蛋白酪氨酸激酶p56<'lck>識別位點(KKTCQC)和內(nèi)化相關(guān)雙亮氨酸基序;氨基酸序列比較結(jié)果表明,豬與人、兔、鼠、狗和貓CD4蛋白的氨基酸同源性分別為56.0﹪、54.5﹪、44.9﹪、56.5﹪和56.9﹪.3、序列

6、分析結(jié)果表明,豬CD8α全長cDNA序列為2179nt,其中5'非翻譯區(qū)165nt,3'非翻譯區(qū)1303nt,開放閱讀框711nt,該開放閱讀框編碼238個氨基酸的豬CD8α前體蛋白(含1個N-糖基化位點).推導(dǎo)氨基酸序列的分析結(jié)果表明,在豬CD8α分子中,7個Cys殘基(Cys<'46>、Cys<'57>、Cys<'118>、Cys<'167>、Cys<'182>、Cys<'216>和Cys<'218>)在哺乳動物種間保守;在豬CD8

7、α分子的胞漿區(qū),存在Src家族蛋白酪氨酸激酶p56<'lck>識別序列CxCP.氨基酸序列比較結(jié)果表明,豬與人、牛、鼠、狗和貓CD8蛋白的氨基酸同源性分別為55.7﹪、57.6﹪、35.6﹪、56.8﹪和56.4﹪.4、從重組質(zhì)粒pGEM-TCD3A、pGEM-TCD4B1L和pGEM-TCD8B中,用PCR方法擴(kuò)增擴(kuò)增豬CD3ε、CD4和CD8α分子的胞外區(qū)基因表達(dá)序列,分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4TCD3E、pGEX-6PCD4