雞CD4、CD8α基因的克隆和原核表達.pdf

1、CD4和CD8分子是T淋巴細胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是T淋巴細胞重要的表面標志。CD4和CD8分子作為粘附分子、輔助受體和免疫調(diào)節(jié)物廣泛參與TCR對MHC分子遞呈抗原的識別和信號傳遞。CD4+T細胞識別MHCⅡ類分子遞呈的抗原，而CD8+T細胞識別MHCⅠ類分子遞呈的抗原。CD4和CD8分子還是一類信號傳遞受體，兩者分子胞質(zhì)內(nèi)部分與非受體型蛋白酪氨酸激酶Src家族p56lck相連，參與經(jīng)TCR介導的信號級聯(lián)反應。最近的研究結(jié)果表明，C

2、D4分子還是HIV感染人T淋巴細胞的輔助受體。CD8αα同型二聚體分子在小鼠腸上皮下與非典型MHCⅠ類分子作用，構(gòu)成腸道免疫屏障。雞和哺乳動物的CD4和CD8分子在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性很明顯，它們與雞的免疫防御緊密相關(guān)，影響機體的細胞免疫和體液免疫。為制備針對雞CD4和CD8α分子的抗體，初步了解這兩種膜蛋白分子在機體特異性免疫應答中的作用及其機理，本研究進行了雞CD4和CD8α基因的克隆和原核表達。 首先根據(jù)GenBank登錄

3、的雞CD4和CD8α基因序列設(shè)計兩對引物，通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(Reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)，從經(jīng)刀豆素A(ConcanavalinA，ConA)誘導活化的雞胸腺淋巴細胞總RNA中分別擴增出兩條特異性基因片段，經(jīng)單酶切鑒定，與GenBank中登錄的雞CD4和CD8α基因序列含有相同的單酶切位點。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到pMD18-T載體，經(jīng)菌液PCR

4、篩選出陽性重組克隆后進行序列測定。結(jié)果表明本實驗成功的克隆到雞CD4和CD8α基因，兩者分別由1380和651個核苷酸組成，分別編碼460和217個氨基酸。所克隆的雞CD4基因與GenBank中登錄的雞CD4基因相比較，都只有1個核苷酸的差異，導致1個氨基酸的改變，同源性均為99％。同樣，所克隆的雞CD8α基因與GenBank中登錄的兩條雞CD8α基因相比較，都有12個核苷酸的差異，分別導致8個和9個氨基酸的變化，同源性為98％。

5、 其次，根據(jù)本實驗測定的雞CD4、CD8α基因序列和原核表達載體pGEX-4T-1的多克隆酶切位點序列設(shè)計兩對引物，應用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒pMD18-T-CD4和pMD18-T-CD8α中擴增出編碼雞CD4和CD8α分子膜外IgSF結(jié)構(gòu)域的基因片段，分別編碼雞CD4胞膜外區(qū)遠端IgSFD1、D2功能結(jié)構(gòu)域和CD8α鏈胞膜外區(qū)的IgSFV功能結(jié)構(gòu)域，這兩個基因片段長度分別為579bp和366bp。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到原核表達載體

6、pGEX-4T-1的多克隆酶切位點，經(jīng)質(zhì)粒PCR和EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，篩選出陽性重組克隆，構(gòu)建成CD4和CD8α基因膜外片斷的原核表達質(zhì)粒。將這兩種原核表達重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-CD4和pGEX-4T-1-CD8α轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)37℃和1.0mmol/LIPTG的誘導，SDS-PAGE凝膠電泳表明所克隆的基因片段在大腸桿菌中得到融合表達，表達出谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與CD4和CD8α的融合蛋白GST-

7、CD4和GST-CD8α，且表達產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。所獲得的融合蛋白分子量分別約為47KD和39KD，與預期結(jié)果相符。 最后，通過優(yōu)化原核表達條件，確定了原核表達重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-CD8α的最佳誘導時間和誘導劑濃度，我們用優(yōu)化的原核表達條件對含有pGEX-4T-1-CD8α質(zhì)粒的BL21菌進行了大量誘導表達，實驗中使用反復凍融和超聲方法來裂解誘導表達菌，獲得了較高濃度的GST-CD8α包涵體蛋白，用十二烷基肌氨