腺病毒介導(dǎo)ZBTB7B siRNA對Jurkat細胞CD4、CD8及P14ARF表達的影響研究.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶靶向鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子小干擾RNA(Zincfinger and BTB domain-containing protein7B siRNA，ZBTB7B siRNA)的重組腺病毒質(zhì)粒，采用腺病毒介導(dǎo)ZBTB7B siRNA沉默Jurkat細胞中ZBTB7B的表達，檢測Jurkat細胞中ZBTB7B及P14ARF基因的表達及細胞表面分子CD4和CD8的表達。
　　方法：采用定向克隆的方法將靶向ZBTB7B siRN

2、A插入到穿梭質(zhì)粒pSES-HUS，酶切及基因測序鑒定正確后命名為pSES-ZBTB7B si；采用同源重組方法將pSES-ZBTB7B si與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1連接，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd5-ZBTB7B si；酶切鑒定pAd5-ZBTB7Bsi，以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將其導(dǎo)入HEK293包裝細胞，乒乓感染法收集高滴度的重組腺病毒Ad5-ZBTB7B si；將重組腺病毒Ad5-ZBTB7B si感染Jurkat細胞，實驗分為3組

3、：實驗組(Jurkat/Ad5-ZBTB7B si)、空載體組(Jurkat/Ad5)、空白對照組(Jurkat)，Real-time PCR法分別檢測Jurkat細胞中ZBTB7B mRNA及P14ARFmRNA的表達；流式細胞術(shù)檢測Jurkat細胞表面分子CD4和CD8的表達。
　　結(jié)果：①酶切及基因測序證實重組腺病毒質(zhì)粒pad5-ZBTB7B si構(gòu)建成功。②熒光顯微鏡證實重組腺病毒Ad5-ZBTB7B si成功導(dǎo)入HEK2

4、93包裝細胞。③獲得高滴度重組腺病毒Ad5-ZBTB7B si。④實驗組ZBTB7B mRNA表達量N(1.403±0.390)×10-3，較空載體組及空白對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.000)。⑤實驗組P14APFmRNA的表達為(7.294±1.228)×10-3，與空載體組及空白對照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.034)。⑥實驗組CD4及CD8的表達分別為(32.45±9.34)％、(49.34±12.45

5、)％，與空載體組及及空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
　　結(jié)論：①成功構(gòu)建及收集高滴度重組腺病毒Ad5-ZBTB7Bsi并順利感染Jukat細胞。②攜帶靶向ZBTB7B siRNA的重組腺病毒Ad5-ZBTB7Bsi能明顯抑制Jukat細胞中ZBTB7B mRNA的表達。③隨著ZBTB7B mRNA表達的下降，Jurkat細胞中P14ARFmRNA的表達顯著升高，證明ZBTB7B與P14ARF的表達密切相關(guān)。④隨著