FoxO1磷酸化對(duì)CD4+胸腺細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞S1P1表達(dá)的影響.pdf

1、背景與目的：
　　T細(xì)胞在胸腺經(jīng)歷CD4-CD8-雙陰性、CD4+CD8+雙陽(yáng)性和CD4+/CD8+單陽(yáng)性階段而逐漸發(fā)育成熟，單陽(yáng)性階段的胸腺細(xì)胞表達(dá)1-磷酸鞘氨醇受體1（Sphingosine-1-phosphate receptor1，S1P1）等分子，在相應(yīng)趨化因子作用下離開(kāi)胸腺到達(dá)外周定居。S1P1是 T細(xì)胞遷出胸腺的關(guān)鍵分子，其表達(dá)受FoxO1-KLF2-S1P1調(diào)控。FoxO1（forkhead transcripti

2、on factors of the O class1）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞核內(nèi)與同源DNA序列結(jié)合促進(jìn)Kruppel樣因子2（Kruppel-like factor2，KLF2）表達(dá)，繼而KLF2影響CCR7、CD62L和S1P1等分子的表達(dá)。TCR活化信號(hào)能通過(guò)PI3K-AKt信號(hào)通路使細(xì)胞核中FoxO1磷酸化并使其轉(zhuǎn)移至胞漿[1]，同時(shí)失去對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子KLF2和下游分子S1P1等表達(dá)的促進(jìn)作用，并因而影響胸腺細(xì)胞的遷出。我

3、們?cè)谇捌诠ぷ髦幸褕?bào)道重癥肌無(wú)力（myasthenia gravis，MG）患者胸腺組織FoxO1、KLF2和S1P1表達(dá)均高于對(duì)照組，為進(jìn)一步闡明MG患者胸腺和外周T細(xì)胞亞群異常在疾病發(fā)生中的作用，本文對(duì)患者CD4+胸腺細(xì)胞表達(dá)FoxO1及其對(duì)下游分子KLF2、CCR7、CD69、S1P1的表達(dá)進(jìn)行了研究?？紤]到患者胸腺細(xì)胞的個(gè)體差異性以及Jurkat細(xì)胞本身的特征，在本研究對(duì)來(lái)自患者的CD4+胸腺細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞系進(jìn)行研究，觀察

4、FoxO1磷酸化及去磷酸化對(duì)這些細(xì)胞下游轉(zhuǎn)錄因子KLF2及S1P1表達(dá)的變化。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象：4例開(kāi)胸手術(shù)獲得的非自身免疫性先天性心臟病者的正常胸腺組織，經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理并制備胸腺細(xì)胞懸液。取出液氮中凍存的Jurkat細(xì)胞于37°水浴鍋中快速?gòu)?fù)蘇，然后將細(xì)胞移至15ml無(wú)菌離心管，向其中一滴一滴加入含有10％胎牛血清1640培養(yǎng)液，邊加邊晃，300g4℃離心10min，棄上清，向其中加入含有10%胎牛血清1640

5、培養(yǎng)液5ml，于37°5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液、每天顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。然后選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。
　　2.免疫磁珠法分選出CD4+胸腺細(xì)胞：吸取單個(gè)胸腺細(xì)胞懸液10μl進(jìn)行計(jì)數(shù)，向1x107個(gè)細(xì)胞（10μl）加入80μl分選Buffer，再加入20μl CD4單抗，充分混勻后4℃避光孵育15min，再加入2ml Buffer混勻，300g4℃離心10min，棄上清，向其中加入500

6、μl Buffer反復(fù)吹打使細(xì)胞重懸，然后再將MS柱子放入磁力架中，加入0.5ml PBE潤(rùn)細(xì)，在重力作用下自然流盡,反復(fù)洗滌后將分離柱移出磁場(chǎng)，加入Buffer并收集，即得到CD4+胸腺細(xì)胞。
　　3. FoxO1磷酸化和去磷酸化試驗(yàn)：分別將CD4+SP胸腺細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞分成三組，第一組為FoxO1磷酸化組。以5μg/ml CD3單抗的包被液將6孔板進(jìn)行包被，4℃冰箱過(guò)夜處理，棄去包被液，加入含1μg/ml CD28單抗

7、和10%胎牛血清的濃度為2×106個(gè)/ ml細(xì)胞懸液2ml；第二組為FoxO1去磷酸化組。在2×106個(gè)/ ml細(xì)胞懸液加入PI3K-AKT信號(hào)通路特異性抑制劑LY29400212.5μg/ml；第三組為對(duì)照組（control）。以含有10%胎牛血清1640培養(yǎng)液孵育；放于37°5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育48h，收集細(xì)胞。
　　4. FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69 mRNA的表達(dá)：分別提取各組細(xì)胞總RNA，采

8、用熒光定量PCR法檢測(cè)FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7、CD69 mRNA的表達(dá)水平，采用2-△△Ct法分析FoxO1磷酸化組、FoxO1去磷酸化組與對(duì)照組比較各基因的相對(duì)表達(dá)差異。
　　5. FoxO1、KLF2、S1P1、P-FoxO1蛋白的表達(dá)情況：分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，通過(guò)Western blot定量法檢測(cè)比較FoxO1、KLF2、S1P1、P-FoxO1蛋白水平，分析其蛋白表達(dá)差異。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

9、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)分析，應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。2組樣本之間的比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism5.0進(jìn)行分析。結(jié)果以P＜0.05被視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1. CD3和CD28單抗對(duì)CD4+SP胸腺細(xì)胞FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69表達(dá)的影響：Real-Time PCR檢測(cè)各組FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69 mRNA水平的

10、變化。結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1磷酸化組FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7 mRNA水平與空白對(duì)照組相比均顯著降低（P＜0.05）。而CD69 mRNA水平與空白對(duì)照組相比發(fā)生顯著增高（P＜0.05）。
　　2. PI3K-AKt信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002對(duì)CD4+SP胸腺細(xì)胞FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69表達(dá)的影響：Real-Time PCR檢測(cè)各組FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7、CD69

11、 mRNA水平的變化。分析結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1去磷酸化組FoxO1 mRNA水平與空白對(duì)照組相比顯著升高（P＜0.05），而KLF2、S1P1 mRNA水平與空白對(duì)照組相比均發(fā)生顯著降低（P＜0.05），而CCR7、CD69 mRNA水平與空白對(duì)照組相比均發(fā)生顯著降低（P＞0.05）。
　　3. CD3和CD28對(duì)Jurkat細(xì)胞FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69表達(dá)的影響：Real-Time PCR檢測(cè)分別處理3

12、h、6h、12h、24h、48h各組的FoxO1、KLF2、S1P1及CCR7、CD69 mRNA水平的變化。CD3和CD28處理48h后的結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1磷酸化組FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7 mRNA水平空白對(duì)照組相比均發(fā)生顯著降低（P＜0.05）。CD69 mRNA水平空白對(duì)照組相比發(fā)生顯著增高（P＜0.05）。
　　4. PI3K-AKt信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002對(duì)Jurkat細(xì)胞FoxO1、KLF

13、2、S1P1及CCR7、CD69表達(dá)的影響：Real-Time PCR檢測(cè)分別處理3h、6h、12h、24h、48h各組的FoxO1、KLF2、S1P1、CCR7、CD69 mRNA水平的變化。LY294002處理48h后的結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1去磷酸化組FoxO1、KLF2、S1P1 mRNA水平與空白對(duì)照組相比均顯著升高（P＜0.05），而CD69 mRNA水平與空白對(duì)照組相比顯著升高（P＞0.05），CCR7 mRNA水平與空白對(duì)照

14、組相比顯著降低（P＞0.05）。
　　5. FoxO1磷酸化和FoxO1去磷酸化對(duì)Jurkat細(xì)胞P-FoxO1、FoxO1、KLF2、S1P1蛋白表達(dá)的影響：CD3和 CD28聯(lián)合處理48h后的 FoxO1磷酸化組FoxO1、KLF2、S1P1蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較顯著降低（P＜0.05）， P-FoxO1蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較顯著升高（P＜0.05）。PI3K-AKt信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002處理48h的