緩激肽對膠質(zhì)瘤細(xì)胞磷酸化CREB、IL-1β和IL-6表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 本文利用免疫細(xì)胞化學(xué)和western-blot方法觀察緩激肽作用下，大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化的動態(tài)變化；并利用RT-PCR技術(shù)和放射免疫法觀察緩激肽作用大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)液中IL-1p、IL-6的表達(dá)變化，及利用RNA干擾(RNA imerference，RNAi)技術(shù)探討CREB的磷酸化是否介導(dǎo)了緩激肽刺激大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)IL-1β的表達(dá)。 材料和方法： 一、實(shí)驗(yàn)材

2、料 1、細(xì)胞 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。 2、主要試劑 DMEM、胰蛋白酶購自Gibco公司；胎牛血清購白天津H&Y生物公司；緩激肽購自Sigma公司；Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；兔抗鼠CREB及磷酸化CREB多克隆抗體購自Cell Signaling公司；SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色劑均購自武漢博士德公司；羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記

3、的IgG二抗購自北京中山生物技術(shù)公司；RNAout，IL-1β、IL-6引物，RT-PCR試劑均購自大連寶生物工程有限公司；siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；IL-1β、IL-6測定試劑盒購自北京東亞免疫技術(shù)研究所。 3、主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡；臺式低溫超速離心機(jī)；超聲粉碎機(jī)電泳儀；轉(zhuǎn)印儀；PCR擴(kuò)增儀；凝膠自動成像儀。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10

4、％的滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置5％的CO<,2>、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，1d更換培養(yǎng)基1次，2～3d傳代1次。 2、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測緩激肽作用下CREB蛋白的磷酸化取對數(shù)生長期的大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，經(jīng)0.25％的胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，以10<'9>L的濃度接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，置5％的CO<,2>、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞生長近單層后，加入1μmol/L緩激肽(終濃度)。分別孵育0、5

5、、10、15、20、30min，棄去培養(yǎng)液，對不同作用時相所得標(biāo)本進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。經(jīng)Motic數(shù)碼攝像系統(tǒng)采集照片，以Motic images advanced 3.O圖象處理軟件進(jìn)行分析。每張切片隨機(jī)選取400倍物鏡下3個視野，計(jì)算平均光密度值表示CREB蛋白磷酸化程度。對照組未經(jīng)緩激肽處理，PBS代替一抗作為陰性對照。 3、Western-blot檢測緩激肽作用下CREB蛋白的磷酸化接種10<'9>/L濃度的大鼠C6膠

6、質(zhì)瘤細(xì)胞于100ml的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，加入緩激肽終濃度至1μmol/L,，分別孵育0、5、10、15、20、30min后，棄去培養(yǎng)液。以PBS液洗后，4℃1000r/min離心10min收集細(xì)胞，然后進(jìn)行western-blot檢測。所得X光膠片用Chemi Imager 5500 V2.0軟件掃描，通過Fluor Chen 2.0軟件進(jìn)行定量分析，測得整合光密度值(integrated density value，IDV

7、)。 4、RT-PCR檢測緩激肽作用下IL-1β mRNA、IL-6 mRNA的表達(dá)PCR引物的設(shè)計(jì)。 5、放射免疫法測定C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)IL-1β、IL-6的含量收集1μmol/L緩激肽分別作用細(xì)胞0～60min的培養(yǎng)上清液，由專業(yè)人員按說明書操作，自動打印結(jié)果。 6、siRNA轉(zhuǎn)染及鑒定siRNA設(shè)計(jì)及合成。 7、RT-PCR檢測CREB特異性siRNA轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞后，緩激肽作用下IL-1β m

8、RNA的表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染CREB特異性siRNA(80riM)72h后，分別用1μmaol/L終濃度的緩激肽作用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞0、5、10、15、30、60min，并設(shè)立轉(zhuǎn)染前空白對照。然后用RNAout試劑提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，然后用Bio-Rad凝膠成像儀成像，并用Fluor ChenV2.0 Stand Alone軟件對圖象進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參照，結(jié)果

9、以IL-1β/GAPDH的IDV比值表示。 8、放射免疫法檢測JJCREB特異性siRNA轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞后，緩激肽作用下培養(yǎng)液中IL-1β的表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染CREB特異性siRNA(80nM)72h后，分別收集緩激肽作用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞0、5、10、15、30、60min的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并設(shè)立轉(zhuǎn)染前對照。由專業(yè)人員按說明書操作。 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理所有數(shù)值以x±s表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<

10、0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、緩激肽可促進(jìn)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子CREB的磷酸化，此作用可能與其促進(jìn)血腫瘤屏障的選擇性開放有關(guān)。 2、緩激肽可刺激大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IL-1β的分泌增強(qiáng)，IL-1β的表達(dá)上調(diào)可能在緩激肽增加血腫瘤屏障通透性的過程中發(fā)揮一定作用。 3、緩激肽作用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞60min以內(nèi)未引起IL-6的表達(dá)增強(qiáng)，這為緩激肽臨床應(yīng)用的安全性提供了有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。