大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6, IL-1β不對(duì)稱分泌及LPS相關(guān)受體的研究.pdf

1、腦不對(duì)稱是機(jī)體的生物學(xué)特性之一,是普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象,主要表現(xiàn)在大腦左右兩半球在解剖結(jié)構(gòu)、遞質(zhì)分泌以及功能等方面存在異質(zhì)性。左、右兩側(cè)大腦皮質(zhì)對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)控具有不對(duì)稱性,大腦皮層和中樞神經(jīng)許多神經(jīng)核團(tuán)可影響機(jī)體的免疫應(yīng)答,且不同部位作用不同。正常機(jī)體左側(cè)皮層擔(dān)負(fù)正反饋免疫調(diào)節(jié),右側(cè)皮層則為負(fù)反饋免疫調(diào)節(jié),兩側(cè)大腦皮層介導(dǎo)不同的免疫功能。神經(jīng)系統(tǒng)可通過(guò) HPA軸調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能,腦不對(duì)稱可通過(guò)不對(duì)稱的神經(jīng)內(nèi)分泌作用于免疫系統(tǒng),使之具

2、有不對(duì)稱性。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞,激活后表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞,是腦內(nèi)細(xì)胞因子的重要來(lái)源和作用部位;相對(duì)星形細(xì)胞,小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)LPS刺激的反應(yīng)性更強(qiáng),LPS與小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面的LPS受體復(fù)合物結(jié)合后,激活小膠質(zhì)細(xì)胞并使其分泌 IL-6,IL-1β等。LPS的受體復(fù)合物包括 CD14,TLR4/MD2,在小膠質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明左、右兩側(cè)大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS刺激24小時(shí)后,右側(cè)大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)

3、胞分泌的IL-6、IL-1β顯著高于左側(cè),即兩側(cè)細(xì)胞因子分泌不對(duì)稱,試想兩側(cè)皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面的LPS受體復(fù)合物的表達(dá)是否也存在不對(duì)稱性呢?而細(xì)胞因子的產(chǎn)生與腦不對(duì)稱呈明顯的相關(guān)性,因此,本文旨在前期研究的基礎(chǔ)上,通過(guò)建立 Balb/c小鼠大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的模型,探討在正常情況及 LPS刺激情況下左、右兩側(cè)大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的變化,以及 LPS受體復(fù)合物在兩側(cè)皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)水平,以期從神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的免

4、疫生物學(xué)效應(yīng)上尋找其與腦不對(duì)稱性的關(guān)系;為揭示腦不對(duì)稱影響免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。我們做了以下工作:
　　1.探討B(tài)alb/c小鼠兩側(cè)大腦皮質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞接受LPS刺激前后IL-6的分泌情況及左、右兩側(cè)分泌情況的比較,以及其與腦不對(duì)稱影響免疫功能間的關(guān)系;
　　2.探討腦不對(duì)稱小鼠大腦皮質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞接受LPS刺激前后IL-1β的分泌情況及左、右兩側(cè)分泌情況的比較,以及其與腦不對(duì)稱影響免疫功能間的關(guān)系;
　　3

5、.初步探討 LPS受體復(fù)合物的在左、右腦兩側(cè)大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá),了解受體表達(dá)是否也存在不對(duì)稱性,以及這種異質(zhì)性是否為引起細(xì)胞因子分泌不對(duì)稱的原因之一。
　　材料和方法：
　　新生(<1d)的BALB/C小鼠,常規(guī)皮膚消毒,斷頭殺鼠,在無(wú)菌條件下迅速剝除硬腦膜,鈍性分離大腦皮層,將左、右兩側(cè)大腦皮層分別制成混合細(xì)胞懸液。培養(yǎng)20-25天,用溫和胰酶消化的方法得到純的小膠質(zhì)細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度5×105/ml

6、。轉(zhuǎn)入6孔板培養(yǎng)24小時(shí)(含10％FCS),24小時(shí)后用無(wú)FCS的培養(yǎng)液輕輕清洗小膠質(zhì)細(xì)胞3次,加入無(wú)FCS的培養(yǎng)液以及LPS,使LPS的終濃度為10μg/ml。培養(yǎng)24小時(shí)收集上清,凍存于-80℃?zhèn)溆?。用雙抗夾心法測(cè)上清中IL-6和IL-1β的含量。6孔板中的細(xì)胞的用途:提取RNA,在RNA水平檢測(cè)LPS受體復(fù)合物的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6、IL-1β水平:
　?、僬?duì)照組

7、左、右腦大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞均分泌少量 IL-6,左、右腦無(wú)明顯差別(P=0.28);用 LPS刺激24小時(shí)后,IL-6濃度明顯增加,且右腦濃度高于左腦(P<0.05)。
　　②正常對(duì)照組左、右腦大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞均分泌少量 IL-1β,且右腦較左腦高(P<0.05);用LPS刺激24小時(shí)后,IL-1β的濃度增加,右腦濃度高于左腦(P<0.05)。
　　2.小鼠大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞LPS受體表達(dá):
　　①半定量PCR分析顯

8、示,小膠質(zhì)細(xì)胞表面有CD14表達(dá),且左、右腦大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)有差別,右側(cè)高于左側(cè),在LPS刺激后CD14表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。
　?、诎攵?PCR分析顯示,小膠質(zhì)細(xì)胞表面有 TLR4有表達(dá),但 MD-2少量表達(dá),LPS刺激后左、右腦大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞有差別,右側(cè)高于左側(cè), TLR4表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.用溫和胰酶消化的方法得到大量高純度的小膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2.左、右兩側(cè)大腦皮

9、質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì) LPS刺激的反應(yīng)性上存在差別,右側(cè)顯著高于左側(cè),提示當(dāng)機(jī)體遭受革蘭陰性細(xì)菌感染時(shí),右側(cè)大腦皮質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞較左側(cè)分泌較多的IL-6。
　　3.左、右兩側(cè)大腦皮質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS刺激下釋放IL-1β水平具有顯著差異,右側(cè)大腦皮質(zhì)的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β明顯高于左側(cè)。
　　4.左、右兩側(cè)大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞膜表面 LPS受體復(fù)合物表達(dá)有明顯差異,右側(cè)高于左側(cè),在LPS刺激后CD14表達(dá)上調(diào),TLR4表達(dá)下調(diào)