RNAi阻斷Act1的表達(dá)對IL-17刺激SW982細(xì)胞分泌IL-6和IL-8影響的研究.pdf

1、研究背景:
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫病，其患病人數(shù)約占全世界總?cè)丝诘?.0％，在我國的發(fā)病率高達(dá)0.32％-0.36％，致殘率達(dá)15％，是一種嚴(yán)重影響人民生活質(zhì)量和生命健康的重大自身免疫病。同其它自身免疫疾病一樣，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的致病原因和發(fā)病機制尚不清楚，目前仍無十分有效的針對性治療。研究發(fā)現(xiàn)RA關(guān)節(jié)軟骨和骨的損傷主要是由于滑膜細(xì)胞的過度

2、活化和增生引起。滑膜成纖維樣細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)是滑膜組織最活躍的組成細(xì)胞，能夠通過自分泌或旁分泌的方式產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子及免疫反應(yīng)介質(zhì)，與RA滑膜的持續(xù)性慢性炎癥、關(guān)節(jié)破壞和滑膜增生有密切的關(guān)系。研究表明，在RA患者滑膜液中存在多種細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TGF-β、TNF-α、GM-CSF等。
　　 核因子κB(nuclear

3、factor kappa B，NF-κB)是參與炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，其調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)滑膜細(xì)胞增生、參與關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)重建，在RA發(fā)病機制中起關(guān)鍵的調(diào)控作用。以NF-κB為靶點，針對其信號通路中的各個環(huán)節(jié)抑制其活化，日前已成為抗炎、抗風(fēng)濕治療研究的熱點。但基礎(chǔ)的NF-κB是機體生長發(fā)育所必須的，因此，找出NF-κB激活途徑的抑制物而不影響其生理活性，將是今后RA治療研究中的一個重要方向。
　　 2000年Li等首次從

4、HEK(human embryonic kidney)細(xì)胞系293中分離出一種60-kD的的蛋白質(zhì)，它能夠結(jié)合并且活化IκB激酶(IKK)，導(dǎo)致NF-κB的活化，稱之為Act1(NF-κB activator1)。與此同時，另外一個研究小組AntonioLeonardi等，應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)在轉(zhuǎn)染的人上皮細(xì)胞和T細(xì)胞中分離出CIKS（connection to IKK and SAPK/JNK），一種能夠與NEMO/IKKγ相互作用的蛋

5、白，它能夠激活I(lǐng)KK和應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK又稱為JNK)信號復(fù)合體。CIKS刺激IKK、p38和JNK，并能夠反式激活NF-κB依賴的指針，因此連接上游信號事件于IKK、SAPK和JNK。后來，CIKS和Act1被證明是同一種蛋白。Act1的過表達(dá)能夠活化NF-κB和JNK(Jun kinnase)途徑。因為Act1能夠活化NF-κB，為此，似乎并不希望Act1表達(dá)于正常的人體組織和器官。抑制Act1的表達(dá)，可能抑制NF-κB的炎

6、癥激活途徑而不影響其生理活性，成為治療RA新的靶點。
　　 Novatchkova等發(fā)現(xiàn)，像IL-17R一樣，Act1含有SEFIR(similar expressionto fibroblast growth factor genes and IL-17Rs)和TRAF6(tumor necrosis factorreceptor associated factor6)結(jié)合區(qū)域，這使得Chang等做出Act1是IL-17RA(

7、IL-17 receptor A)的接頭蛋白這一假設(shè)，并進(jìn)行了實驗證明。當(dāng)應(yīng)用Act1特異的shRNA阻斷Act1在MEFs細(xì)胞中的表達(dá)時，IL-17刺激后所產(chǎn)生的IL-6與對照組細(xì)胞相比顯著降低。Act1缺失的細(xì)胞由IL-17刺激所引起的IκBα的降解被取消。Chang等的研究表明Act1是IL-17R激活與NF-κB活化之間的樞紐。
　　 IL-17具有很強的致炎性，是一種激活破骨細(xì)胞和引起軟骨基質(zhì)破壞的因子。多項研究已經(jīng)證

8、明IL-17在RA的發(fā)病過程中起了重要的作用。IL-17在RA患者關(guān)節(jié)滑膜及滑膜液中大量表達(dá)。在多種類型關(guān)節(jié)炎，滑膜及關(guān)節(jié)軟骨均有IL-17R表達(dá)，在RA的滑膜組織中，IL-17R(+)血管所占百分比最高。IL-17能誘導(dǎo)活化T細(xì)胞，促進(jìn)滑膜細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，抑制軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)，增強破骨細(xì)胞活性，最終導(dǎo)致骨侵蝕，并且能與其他細(xì)胞因子相互作用，導(dǎo)致RA一步發(fā)展。
　　 由此可見，Act1可能通過激活FLS中的NF-κB在RA

9、的發(fā)病機制中發(fā)揮一定的作用，在致炎因子的刺激下，Act1過表達(dá)激活NF-κB，引起各種細(xì)胞因子的表達(dá)增多和凋亡的減少，但目前尚未見文獻(xiàn)報道。
　　 研究目的:
　　 本實驗在于研究Act1在FLS細(xì)胞中基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平并觀察經(jīng)IL-17刺激后的變化，在此基礎(chǔ)上運用RNA干擾技術(shù)抑制編碼Act1的基因Traf3ip2在FLS細(xì)胞中的正常表達(dá)，觀察Act1基因表達(dá)下降后IL-17誘導(dǎo)的IL-6和IL-8表達(dá)的變化。驗證

10、Act1基因異常表達(dá)是否參與了RA的發(fā)病，為下一步的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)理論支持，并為RA的治療提供新的方向。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)人滑膜成纖維樣細(xì)胞至對數(shù)生長期備用。
　　 2.應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及蛋白免疫印跡(Western Blot)方法來檢測SW982細(xì)胞中Act1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。
　　 3.根據(jù)GeneBank中Act1（Traf3ip2）的基因序列，設(shè)計

11、并合成4條特異性Traf3ip2 siRNA的預(yù)混試劑;1條非特異性陰性對照siRNA試劑(DY-547熒光標(biāo)記)。
　　 4.SW982細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng)至對數(shù)生長期，并設(shè)為三組:實驗組(轉(zhuǎn)染Traf3ip2siRNAs)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)與空白對照組（除不含siRNA外，其余試劑與另外兩組相同），分別進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。
　　 5.將DY-547標(biāo)記的陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染入SW982細(xì)胞，使用流式細(xì)胞術(shù)

12、(FCM)測定轉(zhuǎn)染效率，根據(jù)結(jié)果篩選出轉(zhuǎn)染效率最佳優(yōu)化條件進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　 6.應(yīng)用RT-PCR和Western Blot方法分別檢測三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Act1(Traf3ip2)基因mRNA和蛋白的表達(dá)，評價干擾效果。
　　 7.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法檢測細(xì)胞上清中IL-6和IL-8的濃度。
　　 8.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x-)±s）表示

13、定量資料數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.Act1在人滑膜成纖維細(xì)胞中在基因水平及蛋白水平呈陽性表達(dá)。
　　 2.RT-PCR結(jié)果顯示經(jīng)IL-17刺激后Act1 mRNA的表達(dá)水平增高，其增高程度與IL-17的刺激濃度及刺激時間呈正相關(guān)。
　　 3.采用Westem Blot方法檢測三組SW982細(xì)胞株中Act1蛋白的表達(dá)水平，與空白對照組

14、相比，轉(zhuǎn)染特異性siRNA組Act1蛋白的表達(dá)明顯下降，而陰性對照組的表達(dá)量無顯著性差異。
　　 4.siRNA轉(zhuǎn)染效果:熒光標(biāo)記的siRNA通過DharmaFECTTM1轉(zhuǎn)染入SW982細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染近48h，時熒光顯微鏡下粗略觀察轉(zhuǎn)染效果并經(jīng)流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染效率。siRNA和DharmaFECTTM1以終濃度100nmol/l∶2.0μl的比例混合時轉(zhuǎn)染效率最高，以相同條件進(jìn)行后續(xù)研究。
　　 5.ELISA檢測培養(yǎng)

15、上清中細(xì)胞因子IL-6，IL-8的表達(dá)，觀察特異性Traf3ip2siRNA轉(zhuǎn)染SW982細(xì)胞株后IL-17誘導(dǎo)的IL-6，IL-8的表達(dá)量降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.胞質(zhì)銜接蛋白Act1存在于人滑膜細(xì)胞中。
　　 2.經(jīng)IL-17刺激后，Act1在SW982細(xì)胞系中的表達(dá)增加，并且其表達(dá)水平與刺激濃度以及刺激時間成正相關(guān)。
　　 3.RNAi干擾可以有效地抑制Act1基因mRNA和Act1蛋白表達(dá)。