胰島素對(duì)小鼠MIN6細(xì)胞FoxO1細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)穿梭定位的影響.pdf

1、FoxO1是胰島β細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子之一，在細(xì)胞內(nèi)參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡，對(duì)胰島β細(xì)胞的功能具有重要影響。
　　FoxO1-EGFP實(shí)時(shí)成像研究顯示，在小鼠胰島β細(xì)胞或MIN6細(xì)胞，用3mmol/L葡萄糖孵育時(shí)，F(xiàn)oxO1一直在細(xì)胞核顯著分布。當(dāng)分別以16.7mmol/L、30mmol/L葡萄糖或116.16ng/mL、1161.6ng/mL胰島素孵育細(xì)胞10-20min時(shí)，可檢測(cè)到胞質(zhì)熒光增多而細(xì)胞核熒光

2、減少。
　　另有研究表明，用25mmol/L葡萄糖刺激MIN6細(xì)胞和小鼠胰島β細(xì)胞30min時(shí) FoxO1發(fā)生急劇磷酸化并且由細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞質(zhì)，這一效應(yīng)具有時(shí)間（0.5-2h）和劑量（2.5-20mmol/L）依賴性。而分別以0.58ng/mL、5.80ng/mL、580ng/mL和1161.6ng/mL胰島素刺激MIN6細(xì)胞和小鼠胰島β細(xì)胞同樣能夠觀察到FoxO1發(fā)生磷酸化改變，但卻未對(duì)FoxO1的胞質(zhì)-胞核轉(zhuǎn)位進(jìn)行觀察。

3、r>　　為探討胰島素對(duì)FoxO1表達(dá)部位的影響，本實(shí)驗(yàn)擬通過給予不同濃度胰島素孵育小鼠MIN6細(xì)胞，觀察不同濃度胰島素在不同時(shí)間對(duì)β細(xì)胞FoxO1細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)穿梭定位的影響。
　　目的：
　　采用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì) MIN6細(xì)胞胰島素作用后免疫化學(xué)染色觀察FoxO1在不同濃度刺激不同時(shí)間后表達(dá)位置的變化。
　　方法：
　　1．小鼠胰島素瘤MIN6細(xì)胞用DMEM（high glucose)培養(yǎng)基（含有25mm

4、ol/L葡萄糖、15％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素）于25ml培養(yǎng)瓶放置在37℃、5%CO2濃度的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)。
　　2．分別以含25mmol/L和5.5mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基孵育12小時(shí)并檢測(cè)培養(yǎng)上清液胰島素濃度。
　　3．在含5.5mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基基礎(chǔ)上給予50μIU/mL（1.75ng/mL）、100μIU/mL(3.5ng/mL)和150μIU/mL(5.25ng/mL)濃度胰島素

5、分別作用12、24和48小時(shí)。
　　4．細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡觀察FoxO1的細(xì)胞內(nèi)定位。
　　結(jié)果：
　　1．25mmol/L葡萄糖培養(yǎng)MIN6細(xì)胞12小時(shí)胰島素分泌濃度為74.37ng/mL，F(xiàn)oxO1主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；5.5mmol/L葡萄糖培養(yǎng)MIN6細(xì)胞12小時(shí)胰島素分泌濃度為37.46ng/mL，F(xiàn)oxO1主要在細(xì)胞核表達(dá)。
　　2．與對(duì)照組相比，胰島素濃度50μIU/mL組分別在刺

6、激12、24、48小時(shí)后FoxO1熒光強(qiáng)度的胞質(zhì)/胞核比增加，12小時(shí)組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.084），24小時(shí)和48小時(shí)組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；胰島素濃度100μIU/mL組分別在刺激12、24和48小時(shí)后 FoxO1熒光強(qiáng)度胞質(zhì)/胞核比增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；胰島素濃度150μIU/mL組分別在刺激12、24和48小時(shí)后FoxO1熒光強(qiáng)度胞質(zhì)/胞核比增加，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。50μI