細(xì)胞核環(huán)境對(duì)染色質(zhì)高級(jí)構(gòu)象的影響.pdf

1、細(xì)胞核是真核生物特有的細(xì)胞器，它主要由細(xì)胞核被膜、核纖層、細(xì)胞核基質(zhì)、染色質(zhì)及核仁五部分組成。其亞細(xì)胞器相互獨(dú)立又相互關(guān)聯(lián)，共同組成一個(gè)精密有序的有機(jī)整體。細(xì)胞核是遺傳信息存儲(chǔ)和復(fù)制的重要場(chǎng)所，作為調(diào)控細(xì)胞代謝、分化及遺傳的核心中樞，在生命進(jìn)程中發(fā)揮重要的功能。
　　染色質(zhì)是真核細(xì)胞核中遺傳物質(zhì)的存在形式。由 DNA、組蛋白、非組蛋白及部分RNA等組成，是真核生物體內(nèi)最大的單一生物大分子。
　　2m左右長(zhǎng)的DNA被壓縮組裝到

2、直徑6微米的細(xì)胞核中，顯示染色質(zhì)經(jīng)歷了高度有序的折疊壓縮。研究表明染色質(zhì)是層次性有序折疊的。首先DNA纏繞在組蛋白八聚體核心中，形成核小體結(jié)構(gòu)；其次以4個(gè)核小體為結(jié)構(gòu)單元相互垛疊成左手螺旋的30nm結(jié)構(gòu)；最后進(jìn)一步地壓縮形成致密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。根據(jù)致密程度的差異，染色質(zhì)可分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)。
　　染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)3C（Chromosome Conformation Capture）的出現(xiàn)及其衍生技術(shù)4C、5C、Hi-C等的迅速

3、發(fā)展，為染色質(zhì)三維高級(jí)結(jié)構(gòu)的研究帶來了全新的機(jī)遇，開創(chuàng)了三維基因組這一全新的領(lǐng)域。高等動(dòng)物基因組三維高級(jí)結(jié)構(gòu)的5C和 Hi-C研究發(fā)現(xiàn)：染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)分維構(gòu)象，具有拓?fù)鋵W(xué)相關(guān)結(jié)構(gòu)域TAD（Topological Associated Domain），TAD是染色質(zhì)高級(jí)構(gòu)象結(jié)構(gòu)和功能的基本單元。
　　染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)是分層級(jí)折疊的。在有絲分裂間期，不同染色體占據(jù)不同的相對(duì)獨(dú)立但有又穩(wěn)定的空間位置，形成染色質(zhì)領(lǐng)域CT（Chromos

4、ome Territory），染色領(lǐng)域根據(jù)折疊程度的不同可以分為開放區(qū)域和密閉區(qū)域，這些區(qū)域則是由多個(gè)TADs相互聚集組成，TADs則可進(jìn)一步分為拓?fù)鋵W(xué)亞結(jié)構(gòu)域Sub-TADs。分等級(jí)的染色質(zhì)三維高級(jí)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞命運(yùn)的穩(wěn)定維持中發(fā)揮重要作用。
　　研究表明染色質(zhì)總體高級(jí)結(jié)構(gòu)特別是TADs在不同細(xì)胞維持穩(wěn)定，物種之間相對(duì)保守，在單倍體精子細(xì)胞和二倍體成纖維細(xì)胞中，TAD仍然具有較高的一致性。但最近也有報(bào)道指出，染色質(zhì)高級(jí)構(gòu)象是可塑的，

5、在環(huán)境的刺激下，TADs會(huì)作出應(yīng)答并發(fā)生重構(gòu)，提示作為染色質(zhì)折疊的結(jié)構(gòu)和功能單元，TADs具有折疊魯棒性、穩(wěn)定性和一定的彈性。
　　普遍認(rèn)為真核生物中已知唯一的絕緣子蛋白CTCF是染色質(zhì)構(gòu)象的關(guān)鍵組織者，其在介導(dǎo)染色質(zhì)遠(yuǎn)距離的相互作用、幫助建立和維持染色質(zhì)三維高級(jí)結(jié)構(gòu)等方面發(fā)揮重要的功能。但是染色質(zhì)構(gòu)象形成的具體分子機(jī)制等仍不是很清楚。染色質(zhì)的折疊是否遵循自組織的原則根據(jù)其自身性質(zhì)特別是DNA序列實(shí)現(xiàn)自我重構(gòu)？不同細(xì)胞核環(huán)境對(duì)染色

6、質(zhì)折疊得影響如何？在新的核環(huán)境下染色質(zhì)折疊能否自洽完成等問題目前都尚不得而知。
　　針對(duì)上述問題，本研究選用帶有人21號(hào)染色體的動(dòng)物模型TC1小鼠為研究材料，通過分析21號(hào)染色體在人細(xì)胞和鼠細(xì)胞染色質(zhì)構(gòu)象的異同，進(jìn)而揭示細(xì)胞核環(huán)境對(duì)染色質(zhì)高級(jí)構(gòu)象的可能影響。
　　為了以較少的測(cè)序量獲得高精度的21號(hào)染色體構(gòu)象數(shù)據(jù)，本研究基于液相雜交捕獲技術(shù)，建立了單染色體靶向富集的Capture Hi-C（cHiC）技術(shù)，利用生物信息學(xué)分析

7、工具及算法，從全局互作、TAD比較、遠(yuǎn)距離互作、斷裂位點(diǎn)、重排片段等五個(gè)層次進(jìn)行了研究分析。
　　第一部分，為富集21號(hào)染色體特異性片段，減少測(cè)序量，我們建立了單染色特異性捕獲方法。主要包括：正常核型的人胚肝細(xì)胞同步化到中期，低滲制備染色體懸液；利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行21號(hào)單染色體分選；采用MALBAC技術(shù)將21號(hào)染色體進(jìn)行全染色體擴(kuò)增；使用標(biāo)準(zhǔn)的建庫(kù)流程制備可用以轉(zhuǎn)錄的DNA文庫(kù)；采用T7 RNA轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RNA探針的制備；優(yōu)化液相

8、雜交體系，進(jìn)行片段和文庫(kù)的雜交捕獲；用qPCR技術(shù)驗(yàn)證靶向片段和文庫(kù)在捕獲后的富集效率。結(jié)果表明單片段可以得到數(shù)百倍的富集，而文庫(kù)的富集效率約為60倍。
　　第二部分，Capture Hi-C實(shí)驗(yàn)的具體流程及文庫(kù)的質(zhì)量控制。首先處死TC1小鼠，解剖獲取新鮮組織，制備單細(xì)胞懸液；Hi-C實(shí)驗(yàn)制備雜交捕獲模板，并利用NheI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行Hi-C實(shí)驗(yàn)有效性等質(zhì)控檢測(cè)，結(jié)果表明Hi-C文庫(kù)中嵌合片段的比例在70％以上，提示文庫(kù)制備正常

9、；利用制備的RNA探針進(jìn)行雜交捕獲；qPCR結(jié)果表明21號(hào)染色體上特定片段的捕獲倍數(shù)達(dá)到約350倍。
　　第三部分，Capture Hi-C捕獲片段的高通量序列測(cè)定、數(shù)據(jù)質(zhì)控和生物信息學(xué)分析。捕獲片段經(jīng)過文庫(kù)制備、PCR擴(kuò)增等后，在Illumina平臺(tái)使用125bp讀長(zhǎng)的Hiseq2500進(jìn)行高通量序列測(cè)定，獲得170M原始測(cè)序數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)過濾、比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)：Hi-C文庫(kù)的嵌合片段占總的配對(duì)末端Reads數(shù)85%，表明Hi-C建庫(kù)

10、質(zhì)量良好；而來自人21號(hào)染色體有效數(shù)據(jù)占總的Di-tags數(shù)據(jù)的10%，證實(shí)文庫(kù)富集了近13.3倍；最后使用人21號(hào)染色體相互作用數(shù)據(jù)建模，獲得了人21號(hào)染色體的互作圖譜；由于在TC1小鼠中人21號(hào)染色體發(fā)生了重排，我們按照重排片段（包含重復(fù)和倒置）對(duì)TC1小鼠和人IMR90細(xì)胞中相應(yīng)片段進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)重組片段內(nèi)TAD得到了維持；斷裂位點(diǎn)處染色體互作強(qiáng)度和兩側(cè)的互作頻率的分析發(fā)現(xiàn)：在IMR90細(xì)胞和TC1重排的21號(hào)染色體中，而斷裂位點(diǎn)

11、一側(cè)到另一側(cè)的互作均要低于隨機(jī)選取的對(duì)照位點(diǎn)，這表明染色體重排后，重排片段仍然傾向于片段內(nèi)部相互作用。Hi-C數(shù)據(jù)中1%最強(qiáng)的互作分析發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞中這些互作主要集中在1Mb的線性范圍內(nèi)，而TC1重排的人21號(hào)染色體中遠(yuǎn)距離強(qiáng)相互作用所占比例顯著增強(qiáng)。
　　綜上，圍繞染色質(zhì)的高級(jí)折疊是否遵循自組裝的原則、細(xì)胞核環(huán)境是否影響染色質(zhì)高級(jí)構(gòu)象這一科學(xué)問題，我們利用含有人類21號(hào)染色體的TC1小鼠這一獨(dú)特模型，通過單條染色體的流式分選、特

12、異性的擴(kuò)增、RNA捕獲探針的制備、液相Capture Hi-C捕獲以及捕獲片段的高通量序列測(cè)定、互作片段的生物信息學(xué)分析等手段的綜合應(yīng)用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：人的21號(hào)染色體在小鼠細(xì)胞核環(huán)境下，其染色質(zhì)折疊的基本單元TAD得到維持，而且重組斷裂位點(diǎn)處一側(cè)到另一側(cè)互作弱于隨機(jī)對(duì)照，提示重排重組片斷更傾向于重組片斷內(nèi)部之間互作，初步表明染色質(zhì)的折疊具有一定的自洽性；斷裂位點(diǎn)區(qū)域互作強(qiáng)度低，暗示TAD可能作為染色質(zhì)重排和演化的基本單元；此外，我們還發(fā)現(xiàn)