礦物粉塵誘導基因對細胞生物學行為、組蛋白甲基化和異染色質的影響.pdf

1、目的：
　　礦物粉塵誘導基因(mineral dust-induced gene，簡稱mdig)是由長期暴露于礦物粉塵的礦工的肺泡巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)的，mdig也被發(fā)現(xiàn)在c-Myc過表達的腫瘤細胞中高表達，命名為mina53(myc-induced nuclear antigen53)或MINA。因為mdig蛋白主要分布在細胞核，所以還稱之為NO52(nucleolar protein52)。許多人類腫瘤中，比如肺癌、結腸癌、食管鱗狀

2、細胞癌、牙齦鱗狀細胞癌、淋巴瘤、腎細胞癌、成神經細胞瘤、胃癌、肝細胞癌、膽管癌和乳腺癌，mdig的表達增加，表明mdig在人類癌癥形成過程中起到重要作用。然而，mdig基因如何促進癌癥發(fā)展的仍然未完全闡明。
　　Mdig蛋白包含一個保守的JmjC結構域，該結構域被發(fā)現(xiàn)在Fe(Ⅱ)家族和2-氧戊二酸鹽依賴的雙加氧酶參與下發(fā)揮組蛋白去甲基化酶的作用。以前的研究表明在人類氣管上皮細胞系BEAS-2B中，mdig降低組蛋白H3的9位點賴氨

3、酸的三甲基化(H3k9me3)狀態(tài)。同樣在大批人類肺癌標本檢測中被證實，增加mdig表達與H3k9me3的表達水平呈負相關。此外，有證據(jù)證實mdig可能通過促進細胞周期從G1期到S期和/或rRNA的合成影響細胞增殖調節(jié)。而且，mdig被發(fā)現(xiàn)能夠影響核仁外基因的表達，例如在T輔助細胞中抑制IL-4表達。最近研究表明，mdig作為2-氧戊二酸鹽氧合酶負責Rp127a組氨?；u基化，Rp127a是60S核糖體的亞基，對于蛋白質的翻譯起重要作用

4、。
　　H19基因是父系印跡但母系表達的胚基因，轉錄基因間長鏈非編碼RNA(lincRNA)，位于人類染色體11p15.5。在胚胎形成初期，父系及母系的H19等位基因均表達，可是在大多數(shù)成人組織中，因為H19基因位點內高階異染色質結構的形成，父系H19等位基因沉默了，因此DNA甲基化和H3k9me3形成。自從1990年發(fā)現(xiàn)H19基因，它在癌癥發(fā)展中的作用就備受爭議。許多證據(jù)顯示H19更趨向于致癌基因，而非腫瘤抑制基因。首先，很多人

5、類癌癥，包括肝細胞癌，肺癌，食管癌，結腸直腸癌，膀胱癌，前列腺癌，尤文氏肉瘤，生殖細胞癌中H19表達均增加;其次，H19的異位表達加強了乳腺癌細胞的致腫瘤性。再次，通過siRNA減弱肺癌細胞和乳腺癌細胞的集落形成和不依賴支持物生長來沉默H19基因;最后，H19的表達被c-Myc和E2F1致癌基因上調。先前報道過在肝細胞癌中提高JNK1活化增加H19表達。因為mdig與rRNA基因調節(jié)有關，因為基因位點異染色質的形成，許多rRNA基因被抑

6、制。
　　本實驗通過轉染A549細胞系建立沉默和過表達的穩(wěn)定細胞系，評估m(xù)dig基因在細胞增殖、轉移和侵襲中的作用，探索mdig是否也有能力調節(jié)串聯(lián)重復的DNA區(qū)域基因的表達，如H19基因。最終，探討mdig基因在肺癌的發(fā)生發(fā)展中的可能機制。
　　材料與方法：
　　1、細胞培養(yǎng)和轉染
　　人類肺腺癌上皮細胞系A549和人類支氣管上皮細胞系BEAS-2B購于美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)。A549細胞的培養(yǎng)

7、基:RPMI1640培養(yǎng)液（美國Invitrogen公司）+10％胎牛血清（美國Sigma公司）+1％青霉素-鏈霉素溶液（美國Sigma公司）+1％谷氨酰胺（美國Sigma公司）。BEAS-2B細胞培養(yǎng)基:DMEM培養(yǎng)液（美國Invitrogen公司）+5％胎牛血清（美國Sigma公司）+1％青霉素-鏈霉素溶液（美國Sigma公司）+1％谷氨酰胺（美國Sigma公司）。在37℃，5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5×105個細胞傳代到六孔

8、板，培養(yǎng)到細胞覆蓋率達60-70％時，用Lipofectamine2000(Invitrogen)試劑進行轉染。Mdig-GFP質粒和control-GFP質粒，沉默mdig的shRNAs-RFP和control-RFP質粒購于OriGene。為了建立穩(wěn)定的轉染克隆，加入篩選抗生素3周，（過表達的質粒嘌呤霉素濃度2μg/ml，沉默質粒G418濃度1000μg/ml），挑選GFP-或者RFP-陽性的克隆來進行進一步實驗。在一些實驗中，用s

9、iRNA短暫沉默mdig表達。Control-siRNA和mdig-siRNA購于Qiagen。六孔板內的細胞（5×105/孔）傳代時用50 nM/孔siRNA進行反向轉染，24 h后用50 nM/孔siRNA進行正向轉染，應用Lipofectamine RNAiMAX試劑(Invitrogen)并遵照制造商的操作說明。培養(yǎng)24 h或48 h后，裂解細胞獲得RNA或蛋白的提取物。
　　2、Western blotting
　

10、　用RIPA溶液(Millipore)+磷酸酶/蛋白酶抑制劑+1 mM PMSF，超聲，離心提取細胞總蛋白，應用微量BCA蛋白測定試劑盒(Thermo Scientific)進行蛋白定量，按量加入含有1mM二硫蘇糖醇的LDS樣本緩沖液(Invitrogen)中，95℃加熱5 min，10％或者15％ SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉膜到PVDF膜(Invitrogen)，應用相應的抗體檢測相應的蛋白。
　　3、RT-PCR
　

11、　用TRIzol Reagent提取細胞總RNA，在LightCycler480儀器上用SYBRGreen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems)進行轉錄，引物包括:
　　Mdig5'-TCA TGT CGG GCC TAA GAG AC-3'和5'-GGC ATT TGA TTC TGC AAA GG-3'
　　GAPDH5'-CT

12、G AAC GGG AAG CTC ACT GGC ATG GCC TTC-3'和5'-C AT GAG GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA GCC-3'
　　H195'-AAAGACACCATCGGAACAGC-3'和5'-AGAGTCGTGGAGGCTTTGAA-3';
　　IGF25'-TCCTCCCTGGACAATCAGAC-3'和5'-AGAAGCACCAGCATCGACTT-3';
　　

13、Jhdm3a5'-CTGTCCATAAAATATCGAAATACCCTA-3'和5'-TACAGTATATAAATACATAATTTGGGC-3';
　　c-Myc5'-TACCCTCTCAACGACAGCAG-3'和5'-TCTTGACATTCTCCTCGGTG-3';
　　大衛(wèi)星DNA X565'-CTCAGGTCTCTTGGCTTTGC-3'和5'-GTGCGGAGGGTAGAGTGGTA-3'
　　4、免疫熒光

14、
　　6×104個細胞傳代至六孔板，培養(yǎng)24 h，4％甲醛固定，PBS洗三次，每次15 min，封閉液封閉60 min，用溶于抗體稀釋液的一抗孵育，4℃過夜，用溶于抗體稀釋液的熒光二抗孵育，避光室溫1h，PBS洗三次，每次5 min，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液(0.1 mg/ml)孵育2 min，通過熒光顯微鏡觀察。
　　5、細胞增殖實驗
　　5×103/孔細胞，500μl培養(yǎng)液，傳代到96孔板，在檢

15、測時間點上，每孔加入20μl MTT溶液(5 mg/ml溶于PBS，Sigma)，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3.5 h。更換孔內溶液為150μl of DMSO(Fisher)溶解甲瓚結晶。搖床15 min，用Biokineticsplate reader(Bio-Tek Instruments)檢測570 nm-690 nm波長吸光度。
　　6、轉移和侵襲實驗
　　應用BD BioCoatTM MatrigelTM Invas

16、ion和Migration Chambers遵照用法說明檢測細胞的轉移和侵襲能力。培養(yǎng)24 h（轉移）或者48 h（侵襲）后，用棉簽擦除濾過膜上層的細胞，用Diff-Quik Kit染色濾過膜底層細胞后，在顯微鏡下進行細胞計數(shù)。
　　7、染色質免疫沉淀實驗(ChIP)
　　ChIP實驗應用染色體免疫沉淀試劑盒(Millipore)，遵照制造商的操作說明。簡略說，用抗H3K9me3抗體或者作為對照的正常的兔IgG(Santa

17、CruzBiotechnology)免疫沉淀基因組DNA-蛋白復合物，超聲，通過SYBR Green-based quantitative real-time PCR(Roche，LightCycler480)用包含H19基因啟動子和ICR區(qū)域的引物擴增沉淀的DNA。ChIP PCR引物包括:（括號內的數(shù)字顯示相應的GenBank ID AF125183系列區(qū)域）。
　　5'-CCAGCCATGTGCAAAGTATG-3'(974

18、7-9766)
　　5'-CCATCCTGGAATTCTCCAAA-3'(9939-9920)
　　5'-GCGGTCTTCAGACAGGAAAG-3'(9468-9487)
　　5'-CACGTTCCTGGAGAGTAGGG-3'(9673-9654)
　　5'-TCTTCAGGTCGGGCATTATC-3'(8112-8131)
　　5'-GCTGTCCTTAGACGGAGTCG-3'(8290-827

19、1)
　　8、體外組蛋白去甲基化實驗
　　按照先前的報道進行體外組蛋白去甲基化實驗。簡略說，從mdig過表達細胞系用mdig抗體(Abcam)免疫沉淀法獲得mdig蛋白。H3K9三甲基化組蛋白肽鏈(Epigentek)在組蛋白去甲基化溶劑[50 mM Hepes-KOH(pH:7.5)，70μM Fe(NH4)2(SO4)2，1 mMα-ketoglutarate，2mM L-ascorbic acid]中與沉淀復合物在37

20、℃培育1-3 h。為了質譜(MS)分析，反應復合物(1μl)用0.1％ TFA稀釋20倍，用ZipTip pipette tips(Millipore)脫鹽。肽鏈被4μl30％ CH3CN/0.1％ formicacid洗脫三次。收集洗脫物，用5-80％線性梯度的溶液B(80％ ACN and0.1％FA)，用C18反相色譜柱(75μm ID，長度15 cm)中流速250 nL/min，內部在試劑A(0.1％ FA)中用ReproSil

21、-Pur C18-AQμm resin(Dr.Maisch GmbH)包裹，分離超過20 min。在線將Orbitrap Elite儀器(Thermo Scientific)和nanoflow Easy-nLC系統(tǒng)連接。MS數(shù)據(jù)在波長掃描(300-1650 Th)中基于前提豐富用Top-20-rCID數(shù)據(jù)依賴策略篩選碎裂事件。獲得分辨率240000和目標值1e6的全部掃描的MS光譜。關閉電荷態(tài)拒絕功能，電荷態(tài)設置在“未定義”，拒絕單一電

22、荷態(tài)。
　　9、生存率分析和統(tǒng)計
　　應用一個包括1715位肺癌患者的生存信息的Kaplan-Meier生存數(shù)據(jù)庫和通過三個不同版本Affymetrix HG-U133基因芯片獲得的基因表達數(shù)據(jù)庫進行分析。這個數(shù)據(jù)庫包括兩種不同的mdig探針組probes213188_s_at and213189_at。213188_s_at探針組被排除是因為它檢測mdig mRNA3'-UTR的遠端和β-γ-crystallin doma

23、in containing3(CRYBG) mRNA3'-UTR的反義。應用在本實驗生存分析的探針組213189_at是檢測mdig mRNA的open-reading frame(ORF)。生存曲線結果高表達mdig(mdighigh)和低表達mdig(mdiglow)P值＜0.05被認為具有統(tǒng)計學差異。生存數(shù)據(jù)用最佳閾值作為截點。
　　10、統(tǒng)計學分析
　　所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準((x)±s)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)

24、計軟件分析，組間比較采用t檢驗，相關性分析采用pearson檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、實驗一
　　(1)短暫轉染mdig-GFP質粒的免疫熒光結果顯示mdig分布在細胞核仁中，mdig和核仁蛋白在細胞核仁中共存。一些穩(wěn)定轉染的細胞中，mdig分布在細胞核基質和細胞漿中，在細胞分裂間期，內源性mdig分布在細胞核仁，在細胞分裂中期和后期，分布在細胞分裂紡錘體中。
　　(2) RT-PC

25、R顯示在A549細胞中，As3+誘導mdig mRNA增加。經過As3+處理后，免疫熒光染色可見mdig在細胞漿內分布。大部分斑點狀mdig染色信號與壓力顆粒不重合，說明那些胞漿內的mdig的表達斑點，不屬于細胞壓力顆粒。
　　(3) Western blotting結果顯示穩(wěn)定轉染mdig-GFP或者沉默mdig表達的shRNA-RFP的細胞內源性和外源性mdig的表達水平。細胞增殖實驗結果顯示五個過表達mdig穩(wěn)定克隆均促進細

26、胞增殖。通過針對mdig mRNA兩個不同區(qū)域的shRNA沉默mdig表達均抑制細胞增殖。
　　(4)轉移實驗顯示過表達mdig的穩(wěn)定細胞轉移能力減弱，而沉默mdig的細胞轉移能力增強。侵襲實驗顯示過表達mdig的穩(wěn)定細胞侵襲能力減弱，而沉默mdig的細胞侵襲能力增強。通過刪除Jmjc結構域沉默mdig表達影響了BEAS-2B細胞的形態(tài)。
　　(5)高水平的mdig對整體肺癌患者預示著較差的預后。對于沒有淋巴結轉移的患者(A

27、JCC N0)和可能有臨近淋巴結轉移的肺癌患者(AJCC N1)，高水平的mdig預示著較差的預后。對于有遠處淋巴結轉移的肺癌患者(AJCC N2)，高水平的mdig不能預測較差的預后。
　　2、實驗二
　　(1)表達mdig-GFP的細胞DAPI染色減弱，表達高水平內源性mdig的細胞顯示DAPI染色減弱。隨機選擇的低倍鏡視野中顯示GFP信號與DAPI染色信號的強度呈負相關。弱DAPI染色表達mdig-GFP的細胞數(shù)顯著大

28、于正?；驈奃API染色表達mdig-GFP的細胞數(shù)。在高倍放大中，表達mdig被證實通過減少強DAPI染色的簇集和H3k9me3簇集數(shù)目，減少異染色質簇集。
　　(2) mdig shRNA轉染A549細胞沉默mdig的穩(wěn)定細胞系中，僅觀察到臨界的H3K9me3和H3K9me1增加，對H3K27的甲基化狀態(tài)沒有觀察到明顯的作用。siRNA在沉默mdig的細胞中，仍然僅檢測到臨界的H3K9me3增加，對H3K27me3、H3k4me

29、3、H4k20me3的甲基化狀態(tài)沒有觀察到明顯的作用。所有的三個穩(wěn)定表達mdig的克隆跟穩(wěn)定表達空載體的克隆相比，H3K9me3都有不同程度的減少，過表達mdig對H3K27me3、H3K36me3和H3K4me3沒觀察到明確的作用。免疫熒光染色在穩(wěn)定表達mdig shRNA的細胞中，H3K9me3也顯示出臨界的增加。
　　(3)定量RT-PCR顯示mdig過表達增加了正常被異染色質結構抑制的H19，IGF2和大衛(wèi)星X56的表達，

30、mdig上調c-Myc和Jhdm3a的表達，通過shRNA沉默mdig抑制H19的表達。染色質免疫沉淀(ChIP)實驗顯示mdig過表達減少H19基因啟動子區(qū)域的H3K9me3的量。通過shRNA沉默mdig增加了H19基因啟動子和ICR區(qū)域中H3K9me3的量。
　　(4)質譜(MS)圖顯示mdig對H3K9me3有去甲基化作用。免疫沉淀物mdig蛋白對底物組蛋白H3肽鏈的去甲基化活性的定量研究顯示mdig能移除一個、兩個、三個

31、甲基原子團，具有從H3K9me3移除三個甲基原子團的最強能力。
　　(5) Kaplan-Meier點狀圖顯示吸煙或者既往吸煙和高表達mdig mRNA的肺癌患者預后較差。H19的高水平表達與肺癌患者較差的生存期相關。高水平的mdig與無復發(fā)生存期較差的乳腺癌和無進展生存期較差的卵巢癌患者相關。
　　結論：
　　1、實驗一
　　(1) mdig主要分布在細胞核仁，也可以分布在細胞核基質和細胞漿中。
　　(2

32、)致癌物質亞砷酸鈉(As3+)作為應激原能誘導A549細胞中mdig的表達增加，同時增加mdig的胞漿內分布。
　　(3) mdig促進細胞增殖。過表達mdig促進細胞增殖，沉默mdig抑制細胞增殖。
　　(4) mdig抑制細胞的轉移和侵襲能力。過表達mdig細胞的轉移侵襲能力降低，而沉默mdig的細胞轉移侵襲能力增強。
　　(5)臨床上，mdig的表達增加對有遠處淋巴結轉移的肺癌患者(AJCCN2)較好的預后，有一

33、定的預測作用。
　　2、實驗二
　　(1)表達mdig減弱細胞核異染色質染色，使DAPI染色中異染色質簇集，H3K9me3染色簇集消失。
　　(2) Mdig對總H3k9me3起臨界的去甲基化作用，未見對其他的組蛋白有去甲基化作用。
　　(3) Mdig能提高異染色質區(qū)沉默的H19基因和IGF2基因的轉錄水平及衛(wèi)星DNAX56的轉錄水平，沉默mdig能抑制H19基因的轉錄，與mdig去甲基化H19基因的啟動子和I