瘦素信號通路對間充質(zhì)干細胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的:瘦素信號通路缺失(瘦素抵抗)是二型糖尿病的并發(fā)癥之一,現(xiàn)有的研宄顯示,中樞和外周途徑的瘦素信號對骨量、脂肪含量都有較為明顯的影響。但瘦素信號對于兩種不同來源的間充質(zhì)干細胞作用是否相同,與之相關(guān)的作用靶點是什么卻不甚了解。本研宄旨在對瘦素信號在不同來源間充質(zhì)干細胞中的具體作用方式及靶點進行探索,為解釋兩種不同靶器官對于瘦素信號的應(yīng)答提供依據(jù)。
　　方法:實驗一:對瘦素缺失小鼠組(ob/ob),瘦素受體缺失小鼠組(db/db),

2、正常野生型小鼠組(WT),重組瘦素恢復(fù)瘦素缺失小鼠瘦素信號組(ob/ob+1印tin)進行骨形態(tài)學(xué)、成骨和破骨細胞功能、體內(nèi)白色脂肪含量、攝食量的測定。確定瘦素信號缺失對于兩種器官(組織)生理功能的影響。
　　實驗二:以酶消化法和全骨髓法培養(yǎng)脂肪來源和骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(MSCs),經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定表面分子,分組同前。MTT、克隆形成能力試驗(CFUassay)檢測細胞增殖能力,成骨、成脂分化實驗檢測細胞相關(guān)分化能力。PCR與

3、 Western Blot檢測相關(guān)基因與蛋白水平的變化。
　　實驗三:對細胞體外進行PPARy信號與AMPK信號的激活,觀察細胞成脂成骨能力的變化及相關(guān)基因和蛋白表達的變化。
　　結(jié)果:實驗一、MicroCT通過股骨遠端骨密度(BMD)、骨量/組織量(BV/TV)、骨小梁粗細(Tr.Th)、骨小梁數(shù)量(T r.N)骨小梁間距(Tr.S)等骨形態(tài)學(xué)指標檢測提示ob/ob小鼠均明顯高于WT小鼠且WT小鼠高于db/db小鼠。HE染

4、色、新骨形成率(BFR)、抗酒石酸酸性磷酸酶活性(TRAP)、血清成骨破骨標志物檢測提示相同趨勢。骨髓腔油紅0染色提示瘦素信號缺失(Iep-/-)小鼠的骨髓腔內(nèi)有較多脂滴形成。骨長度、皮質(zhì)骨密度檢測提不Iep-/-小鼠較WT小鼠有明顯的下降。Iep-/-小鼠的體重和相關(guān)白色脂肪、攝食量均較WT小鼠有明顯的增加,瘦素信號的恢復(fù)對體重的改變是明顯的。
　　實驗二、分離的脂肪與骨髓來源的間充質(zhì)干細胞經(jīng)流式表面分子鑒定符合干細胞特征。MT

5、T實驗、克隆形成能力提示瘦素信號的缺失方式不同會影響骨髓來源間充質(zhì)干細胞(BMSCs)增殖能力,克隆形成集落骨向分化能力實驗(CFU-O)提示三種來源細胞無明顯差異,而克隆形成集落脂向分化能力實驗(CFU-A)顯示:1印-/-小鼠明顯強于WT小鼠。而脂肪來源間充質(zhì)干細胞(ADSCs)方面,增殖分化相關(guān)實驗結(jié)果提示I印-/-來源的ADSCs增殖能力較強、成骨分化能力較弱而成脂分化能力較強。相關(guān)基因蛋白的結(jié)果與染色結(jié)果一致。重組瘦素可以恢復(fù)

6、瘦素缺失的MSCs的生物學(xué)行為異常。
　　實驗三:PPARy激活劑羅格列酮可明顯增強WT來源ADSCs的脂向分化能力,卻對瘦素信號缺失的ADSCs作用甚微;AMPK激活劑二甲雙胍對不同來源的BMSCs增強成骨分化能力的作用一致。重組瘦素可扭轉(zhuǎn)羅格列酮對MSCs成脂分化過程影響的差異,卻對二甲雙胍造成的成骨能力上升無明顯作用。
　　結(jié)論:1、瘦素信號通路的缺失對小鼠長骨的骨量有明顯的影響,但瘦素缺失與其受體缺失所起的作用不完全

7、相同,提示除外周循環(huán)條件下瘦素的直接作用以外,可能存在瘦素于中樞交感神經(jīng)的信號對骨量存在作用且是主要作用的可能。且瘦素對發(fā)育期的骨形成有較為明顯的影響。瘦素對小鼠體內(nèi)白色脂肪生成的刺激作用兩種不同的信號缺失方式較一致。
　　2、ob/ob小鼠的骨量上升是一種高成骨和高破骨的高轉(zhuǎn)換型骨量上升;db/db小鼠的骨質(zhì)疏松是一種低成骨和低破骨共同作用的低轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松。
　　3、瘦素信號對BMSCs的增殖能力、成脂分化能力影響明顯,