退變椎間盤酸性微環(huán)境對間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、背景：下腰痛是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，它是導(dǎo)致45歲以下人群勞動(dòng)能力受限的最主要原因。流行病學(xué)調(diào)查顯示，全世界約70％的成年人口在一生中至少經(jīng)歷過一次下腰痛。在美國下腰痛每年造成的經(jīng)濟(jì)損失約900億美元，中國衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒顯示2008年我國下腰痛位于所有慢性病患病率的第六位，可見在我國下腰痛造成的社會(huì)生產(chǎn)力損失同樣十分巨大。雖然目前下腰痛的確切病因尚未完全闡明，但椎間盤退變無疑是一個(gè)重要的誘因。椎間盤內(nèi)的髓核細(xì)胞通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)維持椎間

2、盤功能，其數(shù)量減少和隨之帶來的細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡是椎間盤退變重要的病理生理變化。近年來，細(xì)胞移植治療椎間盤退變方興未艾，間充質(zhì)干細(xì)胞具有向髓核樣表型分化的能力，在椎間盤退變的生物學(xué)修復(fù)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，由于椎間盤為乏血供組織，其能量代謝主要依靠糖酵解，導(dǎo)致其內(nèi)部產(chǎn)生酸性、高滲、低氧和炎癥因子蓄積的惡劣微環(huán)境，在椎間盤退變過程中上述微環(huán)境進(jìn)一步惡化，使得間充質(zhì)干細(xì)胞的代謝活力和生物學(xué)修復(fù)能力受到損害，而上述微環(huán)境因素中又以酸性

3、微環(huán)境對間充質(zhì)干細(xì)胞損害作用最為明顯。有研究表明，人類椎間盤內(nèi)的pH值隨椎間盤退變程度的加重而下降。人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有獲取方便、供體部位損傷小、來源豐富和增殖能力強(qiáng)等優(yōu)勢，是一種理想的椎間盤組織工程種子細(xì)胞。人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的供體年齡可能是細(xì)胞活力的一個(gè)重要影響因素，退變椎間盤不同程度的酸性微環(huán)境對人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)活力的損害程度也很可能存在差異。然而，不同年齡來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對退變椎間盤不同程度酸性微環(huán)境的

4、耐受情況目前尚不清楚，闡明退變椎間盤不同程度酸性微環(huán)境對不同年齡組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞存活、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)代謝等生物學(xué)行為的影響，將為椎間盤生物學(xué)修復(fù)研究的種子細(xì)胞選擇提供重要參考。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對退變椎間盤存在一定的修復(fù)作用，但僅僅通過細(xì)胞移植、生長因子及抗炎藥物注射等手段很難確保脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞植入后在退變椎間盤惡劣的微環(huán)境中長期保持生物學(xué)活力并發(fā)揮修復(fù)作用。近年來有學(xué)者在椎間盤內(nèi)發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)

5、胞存在的證據(jù)，進(jìn)一步的研究證實(shí)在人類退變髓核和終板中存在間充質(zhì)干細(xì)胞，在人類纖維環(huán)中存在具有多向分化潛能的祖細(xì)胞;同時(shí)，動(dòng)物的體內(nèi)研究也證實(shí)髓核中存在間充質(zhì)干細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)源性間充質(zhì)干細(xì)胞在椎間盤內(nèi)存在一定的遷移和修復(fù)行為，提示這種新型組織特異性間充質(zhì)干細(xì)胞具有潛在的研究和應(yīng)用價(jià)值。目前，髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的存在已經(jīng)被多項(xiàng)研究所證實(shí)。本課題組在前期工作中成功分離培養(yǎng)出大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞，它具有間充質(zhì)干細(xì)胞的一般特性，能夠?qū)崿F(xiàn)成軟骨

6、、成脂和成骨分化，完全符合國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。然而，作為一種新型組織特異性間充質(zhì)干細(xì)胞，髓核間充質(zhì)干細(xì)胞是否能夠成為一種更加合適的椎間盤組織工程種子細(xì)胞這個(gè)問題尚不得而知。比較退變椎間盤酸性微環(huán)境對髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)代謝等重要生物學(xué)行為的影響，將有助于我們更好的理解這兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，并對其在椎間盤生物學(xué)修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用前景做出正確的評價(jià)，從而為下一步開發(fā)具有潛在

7、應(yīng)用價(jià)值的椎間盤干細(xì)胞修復(fù)技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：退變椎間盤酸性微環(huán)境對人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　目的：研究退變椎間盤酸性微環(huán)境對不同年齡組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活、增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)代謝等生物學(xué)行為的影響，探索適合進(jìn)行脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)的椎間盤微環(huán)境pH閾值，明確供體年齡對人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞酸性微環(huán)境適應(yīng)能力的影響。
　　方法：人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞根

8、據(jù)供體來源分為未成年組（8-12歲，n=6）和成年組（33-42歲，n=6）。設(shè)立pH值7.4的培養(yǎng)條件作為標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件，使用pH值為7.1，6.8和6.5的培養(yǎng)條件分別模擬正常椎間盤、輕度退變椎間盤和嚴(yán)重退變椎間盤的酸性微環(huán)境特征。采用異硫氰酸熒光素橋連膜聯(lián)蛋白-Ⅴ/碘化丙啶染色(Fluorescein isothiocyanate-Annexin-Ⅴ/propidium iodide staining, FITC-AⅤ/PI)測定細(xì)

9、胞存活。采用MTT(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑澳鹽）法測定細(xì)胞增殖。使用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ)、Ⅱ型膠原(Collagen-Ⅱ)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteina

10、se-2，MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制3（Tissue inhibitor of metalloproteinase-3，TIMP-3），p53和細(xì)胞凋亡蛋白酶3(Caspase-3)的mRNA表達(dá)水平，使用酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）測定聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、MMP-2和TIMP-3的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：退變椎間盤酸性微環(huán)境能夠降低未

11、成年組和成年組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和增殖能力，并且抑制它們的聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的基因和蛋白表達(dá)水平。未成年組和成年組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對退變椎間盤酸性微環(huán)境的應(yīng)答模式相似，但是未成年組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對退變椎間盤酸性微環(huán)境的耐受能力強(qiáng)于成年組供體來源的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　結(jié)論：本研究顯示退變椎間盤酸性微環(huán)境是人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞用于椎間盤生物學(xué)修復(fù)的重要有害因素，來源

12、于未成年組供體的人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可能更加適合用于椎間盤生物學(xué)修復(fù)，人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞用于椎間盤生物學(xué)修復(fù)可能在退變早期（當(dāng)退變椎間盤病理組織微環(huán)境pH值大于6.8時(shí)）更加有效。
　　第二部分：退變椎間盤酸性微環(huán)境對大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　目的：研究退變椎間盤酸性微環(huán)境對大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活、增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)代謝等生物學(xué)行為的影響。
　　方法：從健康雄

13、性大鼠身上提取的髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分別在四種不同的pH條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別是標(biāo)準(zhǔn)條件(pH7.4)和模擬正常、輕度退變和重度退變的椎間盤微環(huán)境（pH值分別為7.1，6.8和6.5）;采用異硫氰酸熒光素橋連膜聯(lián)蛋白-Ⅴ/碘化丙啶染色(Fluorescein isothiocyanate-Annexin-Ⅴ/propidium iodide staining，F(xiàn)ITC-AⅤ/PI)評價(jià)細(xì)胞存活，CCK-8（Cell coun

14、ting kit-8）測定細(xì)胞增殖，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)和蛋白印跡法(Westernblot)檢測聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型膠原(Collagen-Ⅰ)、Ⅱ型膠原(Collagen-Ⅱ)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、Ⅳ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(A disintegrin and metalloproteinase wit

15、hthrombospondin motifs4，ADAMTS4)和金屬蛋白酶組織抑制劑3(Tissue inhibitor ofmetalloproteinase-3，TIMP-3)的基因和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：退變椎間盤酸性微環(huán)境能夠顯著抑制大鼠髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的存活與增殖;同時(shí)，該酸性微環(huán)境能夠抑制上述兩種間充質(zhì)干細(xì)胞中聚集蛋白聚糖、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原以及TIMP-3的基因和蛋白表達(dá)水平，并且提高M(jìn)MP-

16、2和ADAMTS4的基因和蛋白表達(dá)水平。但是，與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞相比，該酸性微環(huán)境對髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的存活與增殖能力的抑制作用明顯較弱，同時(shí)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞具有更高的聚集蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和TIMP-3表達(dá)水平，以及更低的MMP-2和ADAMTS4表達(dá)水平。
　　結(jié)論：退變椎間盤的酸性微環(huán)境是髓核間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)椎間盤的主要障礙之一;髓核間充質(zhì)干細(xì)胞較脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞更能耐受該酸性微環(huán)境，因而可能成為一種新型種子