初步探討自然衰老小鼠骨髓間充質干細胞生物學行為及β-catenin對其分化功能的影響.pdf

1、隨著老年人在世界人口的比例大幅增加,老齡化疾病越來越受到人們的重視。其中骨質疏松癥是一種老年人常見的疾病,其特點是骨組織低骨量和顯微結構的惡化。這種疾病的發(fā)生極大增加了老年人骨折的風險。隨著社會人口老齡化,衰老型骨質疏松癥及所導致的骨折已成為一個日益重要的健康和社會問題。在動物體內骨骼是一個不斷變化的過程,骨吸收再重塑并替換為新骨。在年輕人體內中,骨總體數(shù)量的吸收,并形成新骨是平衡的。然而,隨年齡增長這種重構平衡被打破,最終導致骨量減少

2、,骨強度降低,進而導致骨質疏松癥的發(fā)生增加骨折的風險。其中股骨骨折極易受到骨質疏松癥的影響。骨髓間充質干細胞(BMMSCs)是從骨髓組織中提取出來的,數(shù)量非常稀少,但其存在的意義是非常重大的。它具有多向分化功能,以維持骨組織的自我更新,新骨替換舊骨能力。然而衰老狀態(tài)下BMMSCs的生物學行為和骨組織的再生能力的相關報道較少。
　　許多信號通路調節(jié)干細胞的分化方向和數(shù)目,Wnt信號通路作為其中一種信號通路對骨組織改建和新骨形成發(fā)揮了

3、重要作用,β–catenin(β–連環(huán)蛋白)也是決定干細胞向成脂或成骨方向分化轉換的重要調控分子。
　　通過前期實驗,我們檢測到衰老組織來源的BMMSCs低表達β-catenin,提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路可能與衰老狀態(tài)下BMMSCs的成骨或成脂分化有關。我們假設:衰老環(huán)境可以使β-catenin發(fā)生改變,進而導致Wnt/β-catenin信號通路受抑制,使成骨表達下降。
　　目的:
　　1.探討自然衰老對

4、小鼠骨質特征的影響。
　　2.分離并提取自然衰老小鼠的骨髓間充質干細胞。
　　3.檢測自然衰老是否對骨髓間充質干細胞增殖和分化能力產生了影響。
　　4.檢測在衰老環(huán)境下β-catenin是否發(fā)生了變化,過表達β-catenin后對自然衰老來源的BMMSCs的生物學功能產生影響。
　　方法:
　　1.取2月齡和12月齡C57BL/6J小鼠各20只,利用Micro-CT三維立體掃描技術分別對每只小鼠的后肢股骨骭

5、骺端處進行掃描,觀察分析兩組小鼠股骨骭骺端的骨密度及骨小梁相關指標數(shù)值的變化。
　　2.將兩組小鼠脫頸處死后,剝取其股骨和脛骨后,剪去兩端骨組織。利用密度梯度離心法,貼壁法培養(yǎng)出純度較高的BMMSCs,并且采用流式對干細胞表面分子進行鑒定和細胞凋亡狀態(tài)的檢測。SA-β-半乳糖苷酶染色方法檢測兩組衰老相關酶表達變化。
　　3.采用MTT方法對兩組細胞增殖能力進行對比;克隆形成方法研究兩組細胞自我更新能力;通過茜素紅染色和油紅O

6、染色及Real-timePCR的方法研究兩組細胞成骨和成脂分化能力的對比。
　　4.通過Real-timePCR和Westernblot實驗觀察兩組不同來源細胞中β-catenin表達的差異。并且構建β-catenin質粒載體,將實驗分為四組2月齡組;2月齡+成骨/成脂誘導組;12月齡+成骨/成脂誘導組;12月齡+轉染+成骨/成脂誘導。分別對這四組進行茜素紅染色,油紅O染色和Real-timePCR和Westernblot實驗方法

7、,研究其分化功能的差異。
　　結果:
　　1.兩組小鼠股骨經(jīng)Micro-CT掃描和圖像研究顯示:12月齡小鼠股骨骭骺端的松質骨較2月齡組密度減低,骨密度下降。兩組骨小梁參數(shù)統(tǒng)計分析表明:12月齡組骨體積比總體積(BV/TV％)值、骨小梁數(shù)量(Tb.N1/mm)和骨密度(BMDmg/mm3)值均明顯低于2月齡組;而骨小梁間距(TbSum)明顯大于2月齡組,兩組間各參數(shù)相比,差異均有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)。
　　2.

8、我們成功的從兩組小鼠體內提取出了BMMSCs。通過實驗觀察發(fā)現(xiàn):(1)培養(yǎng)初期,細胞大多為短梭形,傳到P3代后細胞形態(tài)逐漸均一,為多角形,星型,衰老組BMMSCs形狀較為鋪展,立體形態(tài)差。到P6代,年輕組和衰老組均表現(xiàn)為形態(tài)不規(guī)則,鋪展伸開。由此確定以下試驗均用P3~5代細胞。(2)經(jīng)干細胞表面分子鑒定顯示衰老組小鼠BMMSCs的干細胞的特異性表達標記CD90在細胞表面標記,陽性表達下降明顯,其余表面標記表達無差異。表明本實驗成功從兩組

9、小鼠體內提取出了BMMSCs。(3)SA-β-半乳糖苷酶為衰老性標記的染色,年輕組僅見少量的SA-β-半乳糖苷酶染色陽性顯示,而衰老組小鼠BMMSCs的SA-β-半乳糖苷酶染色陽性細胞增多。表明從自然衰老小鼠體內提出的BMMSCs的明顯比年輕組的BMMSCs要表現(xiàn)出更明顯的衰老狀態(tài)。(4)細胞凋亡檢測顯示,12月齡組小鼠BMMSCs凋亡水平明顯高于2月齡組。
　　3.MTT和克隆形成檢測顯示,12月齡組BMMSCs增殖能力和自我更

10、新能力較2月齡組減弱。茜素紅染色顯示,12月齡組礦化結節(jié)形成數(shù)量低于2月齡組。Real-timePCR檢測顯示,12月齡組BMMSCs成骨誘導后其Runx2mRNA表達水平明顯低于2月齡組(P<0.05)。油紅O染色顯示12月齡組BMMSCs形成脂滴數(shù)量明顯多于2月齡組小鼠BMMSCs誘導后結果,經(jīng)Real-timePCR檢測PPAR-r在12月齡組誘導后變化較2月齡組大,且表達量高于2月齡組誘導后結果(P<0.05)。
　　4.

11、通過Real-timePCR和Westernblot檢測,在自然衰老小鼠來源的BMMSCs中,β-catenin表達較年輕組明顯下降。并且過表達衰老組BMMSCs中的β-catenin后,成骨相關基因Runx2表達明顯升高,成脂相關基因lpl、PPAR-r表達明顯下降。實驗結果表明在衰老組BMMSCs中過表達β-catenin后,其成骨能力上升,成脂能力下降。
　　結論:
　　1.12月齡小鼠出現(xiàn)了骨衰老癥狀,主要表現(xiàn)為骨密