間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)皮分化前流動加載對所得細(xì)胞表型及生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：通過研究流動切應(yīng)力因素作用于大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)后，對其內(nèi)皮誘導(dǎo)所得細(xì)胞抗血栓形成、血管活性物質(zhì)生成及粘附因子表達(dá)等生物學(xué)性質(zhì)的變化，探討流動切應(yīng)力加載與MSCs內(nèi)皮分化過程相結(jié)合后，能否在體外構(gòu)建出滿足缺血性心臟病(iscllemic heart disease，IHD)治療及心血管組織工程需要的種子細(xì)胞。 方法： 1．采用Percoll分離液密度梯度分離

2、法，體外分離及純化SD大鼠MSCs，經(jīng)過形態(tài)學(xué)特征、表面標(biāo)志物表達(dá)及多向分化潛能等多方面鑒定所得細(xì)胞。將純化后細(xì)胞置入含VEGF及bFGF的內(nèi)皮誘導(dǎo)液中定向誘導(dǎo)2周后，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，免疫熒光染色觀察細(xì)胞CD31表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)方法檢測Ⅷ因子表達(dá)情況，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)。 2．將分離純化所得的大鼠MSCs按照加載切應(yīng)力大小分為靜態(tài)對照組、5dyn/cm<'2>切應(yīng)力加載組和10dyn/cm<'

3、2>切應(yīng)力加載組，切應(yīng)力加載組完成3小時切應(yīng)力加載后，三組均于靜態(tài)下定向內(nèi)皮誘導(dǎo)14天，分別以熒光實時定量逆轉(zhuǎn)錄。聚合酶鏈反應(yīng)(real-timefluorescent quantitation reverse transcription-polymerase chain reaction，real-time RT-PCR)及流式細(xì)胞儀(flow cytometry)觀察所得細(xì)胞的t-PA、eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1

4、等因子mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化情況。流動切應(yīng)力加載組所得細(xì)胞培養(yǎng)3天后傳代，再次檢測傳代后細(xì)胞上述因子的表達(dá)情況。 3．同時也觀察所得細(xì)胞的NO合成量、總抗氧化能力(T-AOC)、及NADPH氧化酶gp91phox亞單位mRNA的變化情況。 結(jié)果： 1．內(nèi)皮誘導(dǎo)2周后，培養(yǎng)細(xì)胞獲得了內(nèi)皮特異性細(xì)胞形態(tài)、排列方式及超微結(jié)構(gòu)，并表達(dá)內(nèi)皮特異性抗原CD31及Ⅷ因子相關(guān)抗原。 2．對MSCs施加生理范圍內(nèi)大小

5、的層流切應(yīng)力3h后，其內(nèi)皮誘導(dǎo)所得P1代細(xì)胞的t-PA、eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1等因子mRNA表達(dá)水平均明顯升高，且與切應(yīng)力強(qiáng)度呈依賴關(guān)系。傳代后P2代細(xì)胞上述因子中，除ICAM-1表達(dá)繼續(xù)升高外，其余因子表達(dá)下降，其中eNOS和ET-1表達(dá)下降明顯，而t-PA和VCAM-1表達(dá)下降不明顯。 3．所得P1代細(xì)胞的eNOS、ET-1、ICAM-1、VCAM-1等因子蛋白表達(dá)水平變化趨勢不同。5 dyn/cm<

6、'2>加載后，eNOS表達(dá)下降，而10 dyn/cm<'2>加載后eNOS表達(dá)增加。其余因子無論切應(yīng)力強(qiáng)度大小，均表達(dá)增加。傳代后P2代細(xì)胞中，5 dyn/cm<'2>組eNOS表達(dá)仍低于對照水平，而10dyn/cm<'2>組水平降低至對照水平。同時其余因子蛋白表達(dá)下降至對照水平。 4．對MSCs施加生理范圍內(nèi)大小的層流切應(yīng)力3h后，其內(nèi)皮誘導(dǎo)所得細(xì)胞的NO產(chǎn)量及T-AOC增加，gp91phox亞單位mRNA表達(dá)下降，均與切應(yīng)力

7、強(qiáng)度呈依賴關(guān)系。 結(jié)論： 1．成年SD大鼠骨髓MSCs能在體外定向誘導(dǎo)為內(nèi)皮細(xì)胞，有望成為心血管疾病的細(xì)胞治療及相關(guān)心血管組織工程理想的種子細(xì)胞來源。 2．生理范圍內(nèi)流動切應(yīng)力能對由MSCs分化而來的內(nèi)皮細(xì)胞抗血栓能力、抗氧化能力、血管活性物質(zhì)生成及粘附分子表達(dá)等多方面進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控。其調(diào)控效果及強(qiáng)度因細(xì)胞因子的不同而不同。這可能是由于不同的細(xì)胞因子是通過各自特異的分子機(jī)制來對同一類型切應(yīng)力作出反應(yīng)的結(jié)果。