軟骨細胞微環(huán)境對滑膜間充質(zhì)干細胞分化的影響.pdf

1、目的：滑膜間充質(zhì)干細胞在體外具有多向分化的能力，相比較其他間充質(zhì)干細胞的來源，滑膜是最接近關(guān)節(jié)軟骨的組織，具有很高的成軟骨能力有望成為軟骨組織工程中治療軟骨缺損的種子細胞，本研究的目的利用富含生長因子的軟骨細胞上清液誘導(dǎo)滑膜間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化，并對其鑒定。為構(gòu)建顳下頜關(guān)節(jié)盤進一步研究創(chuàng)造條件。
　　方法：（1）無菌條件下獲取大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)的滑膜組織和軟骨。消化法分離軟骨細胞和滑膜間充質(zhì)干細胞，體外培養(yǎng)、擴增。收集軟骨細胞上

2、清液離心、過濾、凍存?zhèn)溆谩＃?）培養(yǎng)滑膜間充質(zhì)干細胞至第3代后離心成微團（細胞數(shù)為1×106個/ml），使用軟骨上清液為培養(yǎng)基，微團培養(yǎng)21天，以正常的滑膜細胞為實驗對照組。（3）HE染色后觀察形態(tài)，甲苯胺藍染色檢測細胞外基質(zhì)合成情況，（4）采用RT-PCR檢測RNA水平上Ⅱ型膠原、SOX-9、蛋白多糖基因表達的影響。（5）采用免疫組織化學(xué)法及免疫印跡法（Western Blot）檢測軟骨特異性蛋白的表達。
　　結(jié)果：培養(yǎng)3周后，

3、細胞形態(tài)呈現(xiàn)類似的軟骨細胞樣特征：呈白色、表明光滑，具有一定韌性。HE染色可觀察到細胞呈似圓形，周圍有基質(zhì)包繞。甲苯胺藍染色顯示合成了細胞外基質(zhì)—氨基多糖。Ⅱ型膠原免疫組化學(xué)檢測后可見胞漿和細胞外有棕黃色顆粒。實驗進一步通過RT-PCR.、免疫印跡技術(shù)檢測Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、SOX-9軟骨特異性基因和蛋白的表達。證實軟骨細胞分泌的可溶性因子可以誘導(dǎo)大鼠滑膜間充質(zhì)干細胞向軟骨方向分化。
　　結(jié)論：滑膜間充質(zhì)干細胞與軟骨細胞混合培養(yǎng)后