骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液對(duì)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化影響的研究.pdf

1、目的：
　　一直以來(lái)，軟骨缺損的修復(fù)都是骨科領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，因?yàn)殡y以在軟骨缺損區(qū)重建真正的透明軟骨，以實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的功能。軟骨細(xì)胞移植的方法解決了這個(gè)問(wèn)題，可以在軟骨缺損區(qū)形成透明軟骨，實(shí)現(xiàn)真正的關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和功能，但這種方法需從自體正常軟骨取材，細(xì)胞來(lái)源有限，且存在多種并發(fā)癥。間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度增殖和多向分化能力，可大量增殖并分化為軟骨細(xì)胞，解決了自體軟骨細(xì)胞移植的弊端。目前研究表明，在骨髓、滑膜、脂肪、肌膜等不同組織來(lái)源

2、的間充質(zhì)干細(xì)胞中，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovium-derived stem cells，SDSCs)在增殖和軟骨分化能力上優(yōu)于其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞。骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是臨床中的常見病，以軟骨退變和軟骨缺損為主要病理表現(xiàn)，常常導(dǎo)致嚴(yán)重的疼痛和功能障礙。如果用SDSCs作為種子細(xì)胞治療OA關(guān)節(jié)的軟骨缺損，需將SDSCs在體外增殖并誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞，再移植回軟骨缺損區(qū)，必然會(huì)處于OA關(guān)節(jié)內(nèi)退變性炎癥環(huán)境中

3、，其軟骨形成能力可能會(huì)受到炎癥環(huán)境的影響，如果存在影響？如何影響，是抑制還是促進(jìn)軟骨形成？SDSCs是否可以作為種子細(xì)胞治療OA關(guān)節(jié)的軟骨缺損？以上問(wèn)題目前仍無(wú)答案。本實(shí)驗(yàn)旨在研究OA關(guān)節(jié)的退變性炎癥環(huán)境是否對(duì)SDSCs的軟骨分化能力產(chǎn)生影響？如果存在影響，分析其影響方式，是抑制還是促進(jìn)？探討SDSCs是否可以作為治療OA關(guān)節(jié)軟骨缺損的種子細(xì)胞？
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)首先在臨床中隨機(jī)選取隨因膝關(guān)節(jié)OA行關(guān)節(jié)置換的病人12例

4、，其中男4例，女8例，平均年齡64.4歲。提取手術(shù)中需切除的滑膜組織，并抽取關(guān)節(jié)液。將滑膜組織中的SDSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)，并傳代擴(kuò)增，繪制MTS細(xì)胞增殖曲線，探討其細(xì)胞增殖能力。采用流式細(xì)胞術(shù)分析其間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物:CD44、CD45、CD90、CD105的表達(dá)情況，并向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，采用組織化學(xué)染色方法觀察誘導(dǎo)結(jié)果。成軟骨誘導(dǎo)分化采用2種培養(yǎng)方法:平板培養(yǎng)和細(xì)胞團(tuán)懸浮培養(yǎng)。鑒定分離培養(yǎng)的細(xì)胞是否為間充質(zhì)干

5、細(xì)胞，并分析其軟骨分化形成能力。然后將成軟骨誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入OA關(guān)節(jié)液，模擬OA關(guān)節(jié)內(nèi)的退變性炎癥環(huán)境。然后采用多種方法分析比較2組細(xì)胞的軟骨形成能力，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)常見透明軟骨標(biāo)志性基因的表達(dá)情況，包括:COLⅡ、Aggrecan、SOX9基因，然后采用Westemblots方法檢測(cè)其相應(yīng)蛋白的合成情況，并測(cè)量2組細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)形成的軟骨小球的直徑。
　　結(jié)果：
　　本實(shí)

6、驗(yàn)在體外條件下，從OA關(guān)節(jié)滑膜組織中成功分離出SDSCs，MTS細(xì)胞增殖曲線顯示SDSCs增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞數(shù)量平均72小時(shí)擴(kuò)增1倍。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示CD45陰性，CD44、CD90、CD105陽(yáng)性，多向誘導(dǎo)分化后細(xì)胞染色結(jié)果顯示可以向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化，并產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)。成軟骨誘導(dǎo)分化細(xì)胞團(tuán)懸浮培養(yǎng)可見軟骨小球形成，以上說(shuō)明OA關(guān)節(jié)滑膜組織中可以分離出SDSCs，并向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，形成軟骨基質(zhì)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)

7、果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Ⅱ型膠原(collagenⅡ，COLⅡ)、Aggrecan、SOX9基因mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，Western blots結(jié)果顯細(xì)胞COLⅡ、Aggrecan、SOX9蛋白的合成高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞團(tuán)形成軟骨小球的直徑明顯大于對(duì)照組，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。說(shuō)明OA關(guān)節(jié)液可以促進(jìn)SDSCs的軟骨分化形成能力。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在體外條件下OA關(guān)節(jié)