血清和關(guān)節(jié)液中ykl對骨性關(guān)節(jié)炎

1、血清和關(guān)節(jié)液中YKL-40對骨性關(guān)節(jié)炎診斷價(jià)值的研究,導(dǎo) 師: 衛(wèi)小春教授研究生: 王國金,科研開題報(bào)告,一、課題簡介,關(guān)節(jié)軟骨特性：光滑、耐磨、富有彈性及一些特有的機(jī)械性能 功能：傳導(dǎo)載荷、吸收震蕩、潤滑關(guān)節(jié),,由于關(guān)節(jié)軟骨沒有血管、神經(jīng)，一旦損傷，很難自我修復(fù)(once destoryed，is not repaired),Alginate,實(shí)驗(yàn)流程圖,謝謝！,前言,關(guān)節(jié)軟骨是一種高度分化的組織，由于缺乏血供，損傷

2、后很難自我修復(fù)（once destoryed，is not repaired）,Autologous Chondrocyte Transplantation（ACT）,1994年， Brittberg,謝謝,國內(nèi)外曾用多種修復(fù)方法來治療軟骨損傷，如刨削成形術(shù)、微骨折術(shù)、軟骨下骨鉆孔術(shù)等，其基本原理是利用生物或機(jī)械因素使骨髓中的多能干細(xì)胞到達(dá)軟骨缺損區(qū)，并進(jìn)一步分化為軟骨及骨組織。研究發(fā)現(xiàn)形成的軟骨為纖維軟骨或類透明軟骨，且該軟骨容易發(fā)

3、生退變。,謝謝,本研究所屬領(lǐng)域 范圍及性質(zhì),骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)生物學(xué)標(biāo)志物(Biomarkers, Biological Markers,marker. BM)的研究領(lǐng)域。采用橫斷面研究的方法,對OA體液中生物學(xué)標(biāo)志物之一— YKL-40(又稱人軟骨糖蛋白-39,human cartilage glycoprtein-39,HC gp-39/GP-39)進(jìn)行的臨床診斷性試

4、驗(yàn) 研究。,OA概況(1),OA是引起關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)受限的常見病變,是世界性的關(guān)節(jié)疾病。在美國50歲以上的人群中已成為勞動(dòng)力喪失的第二大疾患。在我國OA的發(fā)病率:農(nóng)村為9.6%,城市人群為4.9%。,OA概況(2),OA是以疼痛、腫脹、活動(dòng)受限、彈響，有時(shí)伴關(guān)節(jié)積液，以及不同程度的局部炎癥,但無全身癥狀為特點(diǎn)的關(guān)節(jié)病。OA的病理生理學(xué)特點(diǎn)： 負(fù)重部位的不規(guī)則軟骨喪失； 軟骨下骨硬化、囊性變、邊緣骨贅形成

5、 不同程度的滑膜炎癥。,OA診斷的現(xiàn)狀,目前臨床所通用的是1986年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)關(guān)于OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要是以癥狀+X線征像為依據(jù)的?，F(xiàn)有檢查手段對OA軟骨退變診斷的局限性 MRI X線 其征象改變比軟骨發(fā)生退變遲3-5年。,OA的生物學(xué)標(biāo)志物(BM) (1)----概況,近年來國內(nèi)外學(xué)者欲在OA患者的體液中尋找理想的病變標(biāo)志物，來及時(shí)反映關(guān)節(jié)軟骨代謝狀態(tài)和局部病變的進(jìn)展情況，揭示病情活動(dòng)或預(yù)后

6、，并為臨床提供療效評價(jià)的客觀依據(jù)。美國國立衛(wèi)生研究院2000年建議用Biomarker取代marker,這樣可更好地揭示其生物學(xué)本質(zhì)。,OA的生物學(xué)標(biāo)志物(BM) (2)----研究現(xiàn)狀,大量實(shí)驗(yàn)研究已發(fā)現(xiàn)許多能反映OA病情的BM： 反映骨代謝的BM； 反映軟骨代謝的BM； 反映滑膜代謝的BM。 YKL-40：可能是反映軟骨和滑膜代謝的BM之一。 近年來，國外開始進(jìn)行

7、臨床試驗(yàn)研究。,OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（2）——研究現(xiàn)狀（1）反映骨代謝的BM,合成代謝I型膠原：I型前膠原氨基端前肽, I型前膠原羧基端前肽。非膠原蛋白：骨特異性堿性磷酸酶; 骨鈣素 。分解代謝I型膠原：脫氧吡啶酚, 吡啶酚; I型膠原氨基端端肽, I型膠原羧基端端肽-1,2 。非膠原蛋白：血漿酒石酸鹽耐受性酸性磷酸酶, 骨唾液蛋白。,OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（2）——研究現(xiàn)狀（2）反映軟骨代謝的BM,合

8、成代謝Ⅱ型膠原：Ⅱ型前膠原羧基端前肽, ⅡA型前膠原氨基端前肽?？删鄣鞍锥嗵牵毫蛩彳浌撬乇砦?46, 3B3, 7D4。其它蛋白：YKL-40即人軟骨糖蛋白-39 分解代謝Ⅱ型膠原：吡啶酚; Ⅱ型膠原新表位COL2-3/4m, COL2-1/4N1; Ⅱ型膠原羧基端端肽。可聚蛋白多糖：可聚蛋白多糖片斷; 硫酸角質(zhì)素表位 5D4,AN9P1; 其它蛋白：軟骨寡聚基質(zhì)蛋白。,OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（2）——研究現(xiàn)狀（3）

9、反映滑膜代謝的BM,合成代謝I型和III型膠原： I型前膠原羧基端前肽, III型前膠原氨基端前肽。非膠原蛋白：透明質(zhì)酸; YKL-40 ; 軟骨寡聚基質(zhì)蛋白; 基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子。分解代謝I型和III型膠原：葡萄糖-半乳糖-吡啶酚; I型膠原羧基端端肽-2。,YKL-40概況,YKL-40（又稱人軟骨糖蛋白-39，human cartilage glycoprtein 39，HC gp-39/ GP-39）在非泌

10、乳期牛的乳清分泌物中被首次發(fā)現(xiàn)的。來源：軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等。相對分子量為40 000的糖蛋白，含383個(gè)氨基酸。由10個(gè)外顯子構(gòu)成的含開放讀碼框架完全互補(bǔ)cDNA序列編譯。是殼質(zhì)酶(chitinase)糖蛋白家族的成員, 但不具備殼質(zhì)酶活性。,YKL-40的研究現(xiàn)狀（1）,目前YKL-40的相關(guān)研究主要集中于以下領(lǐng)域：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；骨性關(guān)節(jié)炎；巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎；肝纖維化；乳腺癌和結(jié)腸直腸癌，

11、等等。雖然YKL-40的作用機(jī)制尚不清楚，但研究表明它與許多組織的重塑和細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)。,YKL-40的研究現(xiàn)狀（2）,關(guān)節(jié)液內(nèi)YKL-40是軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。OA患者[Volck] ：YKL-40在關(guān)節(jié)液中含量增加；血清水平也升高。Johansen報(bào)道：血清和關(guān)節(jié)液中YKL-40水平是反映滑膜炎時(shí)滑膜合成代謝水平的指標(biāo)。Volk等的研究表明：YKL-40可能在OA的關(guān)節(jié)軟骨降解和重塑形中也起著重要作用。,

12、YKL-40的研究現(xiàn)狀（3）,YKL-40是一個(gè)反映滑膜和關(guān)節(jié)軟骨代謝的BM?經(jīng)檢索十年的CBMDisc未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)關(guān)于YKL-40在骨性關(guān)節(jié)炎方面的研究論文發(fā)表。,OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（3）——血清BM研究中的混雜因素,血清BM除反映關(guān)節(jié)的病情外，還可能受其它因素的影響：生物節(jié)律的影響腸蠕動(dòng)的影響體育活動(dòng)的影響肝腎等疾病的影響年齡和性別的影響手術(shù)的影響藥物因素的影響,OA的生物學(xué)標(biāo)志物（BM）（4）--現(xiàn)有臨床

13、診斷性研究論著的局限性,多以O(shè)A患者X線征象的Kellgren&Lawrence分級作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，來對照評價(jià)OA病情嚴(yán)重程度。充分考慮混雜因素控制的相關(guān)論著也不多見。,本研究目的,明確關(guān)節(jié)液（synovial fluid, SF）中YKL-40水平對膝OA的診斷價(jià)值；探討血清（Serum）中YKL-40水平對膝OA的診斷價(jià)值。,本研究的特點(diǎn),診斷試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)軟骨損傷和滑膜炎病理變化程度的評分；WOMAC

14、骨性關(guān)節(jié)炎指數(shù)（由患者自我評估）；X線的Kellgren&Lawrence分級，負(fù)重位X線的膝關(guān)節(jié)間隙寬度。充分控制混雜因素探討血清YKL-40診斷價(jià)值。,本研究的意義,學(xué)術(shù)意義可以明確YKL-40對OA的診斷價(jià)值；可為OA的癥狀解釋、早期診斷及其分期提供一種實(shí)驗(yàn)室檢查手段；可為OA的治療提供一種療效評價(jià)的客觀指標(biāo)；可為進(jìn)一步研究確定國人體液YKL-40的正常參考值奠定基礎(chǔ)。 經(jīng)濟(jì)效益近期效益；遠(yuǎn)期效益。,

15、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,X線評價(jià),體液YKL-40的檢測（ELISA）,體液標(biāo)本的預(yù)處理和儲(chǔ)存,OA病變程度的評價(jià),術(shù)中關(guān)節(jié)鏡下觀察,采集關(guān)節(jié)液標(biāo)本,采集血液標(biāo)本,膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)時(shí),術(shù)前化驗(yàn)時(shí),病例選擇,關(guān)節(jié)軟骨退變和滑膜炎關(guān)節(jié)鏡分級,關(guān)節(jié)液和血清YKL-40濃度,Kellgren&Lawrence 分級,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,技術(shù)路線,,,功能評估,,,,WOMAC指數(shù),,,,,專業(yè)結(jié)論,,技術(shù)關(guān)鍵

16、,體液標(biāo)本的采集和預(yù)處理體液標(biāo)本的檢測統(tǒng)計(jì)學(xué)的統(tǒng)計(jì)處理,研究方法（1） ——病例選擇,病例來源：山醫(yī)二院骨科行膝關(guān)節(jié)鏡檢查和膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者。擇入標(biāo)準(zhǔn):非發(fā)育期患者（年齡＞18歲）；排除肝腎疾病、全身感染和癌癥等的患者；體液標(biāo)本采集前兩月未使用糖皮質(zhì)激素類藥物的患者。樣本含量：≥60例。,研究方法（2）——體液標(biāo)本的采集、預(yù)處理、儲(chǔ)存和檢測,體液標(biāo)本的采集、儲(chǔ)存前處理、儲(chǔ)存和取用、以及檢測前處理和檢測，應(yīng)依據(jù)課題技術(shù)

17、規(guī)范進(jìn)行。本課題相關(guān)技術(shù)規(guī)范主要參考《Poole R. NIH White Paper: Biomakers, the Osteoarthritis Initiative (A Basis for Discussion). Ferbruary 3rd,2000.》制定。,技術(shù)規(guī)范（1） ——體液標(biāo)本的采集,體液標(biāo)本的采集規(guī)范血液標(biāo)本在清晨6-8時(shí)空腹抽取靜脈血5ml，留存于無菌非抗凝試管中送檢。并應(yīng)限制病人在采集標(biāo)本前活動(dòng)。關(guān)節(jié)

18、液標(biāo)本在行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)時(shí)麻醉后采集：抽取關(guān)節(jié)液原液留存于無菌非抗凝試管中（盡量多抽取）。,技術(shù)規(guī)范（2）——體液標(biāo)本的儲(chǔ)存前處理,體液標(biāo)本均應(yīng)在采樣后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行離心處理：血清標(biāo)本：在至少×600g，3000rpm， 10分鐘的條件下離心。關(guān)節(jié)液標(biāo)本：在×2500g，4℃，15分鐘的條件下離心。 （4500rpm，20min）,技術(shù)規(guī)范（3） —體液標(biāo)本的儲(chǔ)存和取用,體液標(biāo)本的儲(chǔ)存標(biāo)本離心后取上清液，經(jīng)快速冷

19、凍后, -70℃條件下凍存。體液標(biāo)本的取用在室溫下復(fù)溫解凍。標(biāo)本避免反復(fù)凍融。,技術(shù)規(guī)范（4） ——體液標(biāo)本檢測前處理和檢測,體液標(biāo)本的檢測前處理關(guān)節(jié)液標(biāo)本應(yīng)先經(jīng)離心后，取上清液測定其含量；血清標(biāo)本不需進(jìn)行特殊處理。體液標(biāo)本的檢測ELISA法。,研究方法（3）——其它相關(guān)資料的收集,臨床資料一般資料；臨床癥狀、體征；問卷調(diào)查：WOMAC指數(shù)實(shí)驗(yàn)室檢查資料常規(guī)項(xiàng)目，血清Ⅳ型膠原。X線資料關(guān)節(jié)間隙的寬度；K

20、ellgren&Lawrence分級。 手術(shù)資料關(guān)節(jié)軟骨損傷和滑膜炎程度的評分；手術(shù)錄像資料。,技術(shù)規(guī)范（5） ——手術(shù)資料收集的注意事項(xiàng),手術(shù)中對關(guān)節(jié)內(nèi)組織的病變程度進(jìn)行評價(jià)：關(guān)節(jié)軟骨損傷：Outerbridge膝關(guān)節(jié)軟骨損傷評分法；滑膜炎：Ayral膝滑膜炎評分法。術(shù)中對病變部位用探鉤進(jìn)行相對測量，并注意留存錄像資料。,研究方法（4）—OA病變程度的對照評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),關(guān)節(jié)組織的關(guān)節(jié)鏡征象評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)關(guān)節(jié)軟骨退變程

21、度：Outerbridge法 ；滑膜炎程度： Ayral膝滑膜炎評分法。OA病變程度的X線征象評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Kellgren&Lawrence 分級；負(fù)重位的膝關(guān)節(jié)間隙寬度。OA病變程度的患者自我評估標(biāo)準(zhǔn)WOMAC骨性關(guān)節(jié)炎指數(shù)。,研究方法（5）—統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,使用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析OA組和非OA組之間體液YKL-40水平的比較用多元協(xié)方差分析。體液YKL-40水平與關(guān)節(jié)鏡下相關(guān)組織的病變程度評分之間用

22、多元線性回歸。體液YKL-40水平與膝關(guān)節(jié)間隙寬度或WOMAC評分間用相關(guān)分析。,可能遇到的問題及解決辦法,標(biāo)本的采集、預(yù)處理和檢測等的標(biāo)準(zhǔn)化嚴(yán)格依據(jù)課題技術(shù)規(guī)范進(jìn)行，才能保證結(jié)果的有效性和可比性。混雜因素的控制探討血清YKL-40水平對OA診斷價(jià)值的關(guān)鍵。,混雜因素的控制（1）,生物節(jié)律影響的控制血液標(biāo)本的采集在固定時(shí)間（清晨6-8時(shí)）進(jìn)行。腸蠕動(dòng)影響的控制血液標(biāo)本在清晨空腹時(shí)采集。體育活動(dòng)影響的控制采集血液標(biāo)本前限

23、制病人的體育活動(dòng)。,混雜因素的控制（2）,肝腎等疾病影響的控制選擇肝腎功能均正常的病例；若樣本含量不足時(shí)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行控制。經(jīng)術(shù)前檢查可排除全身感染和腫瘤等的影響。年齡和性別影響的控制采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行控制。,混雜因素的控制（3）,手術(shù)影響的控制由于體液標(biāo)本是在麻醉后手術(shù)前采集的，故麻醉的影響可忽略。藥物因素影響的控制采集標(biāo)本前兩月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素類藥物。,進(jìn)度安排,2005年1月~2005年4月文獻(xiàn)檢索，課題設(shè)

24、計(jì)，課題技術(shù)規(guī)范的制定,開題報(bào)告。2005年5月~2005年9月標(biāo)本的采集和預(yù)處理，臨床和手術(shù)資料的收集。2005年10月~2005年12月預(yù)實(shí)驗(yàn)，部分體液標(biāo)本YKL-40含量的測定，分析關(guān)節(jié)液和血清YKL-40水平與膝骨性關(guān)節(jié)炎WOMAC評分和X線分級的相關(guān)性。2006年1月~2006年2月體液標(biāo)本YKL-40含量的測定，分析關(guān)節(jié)液和血清YKL-40水平與膝關(guān)節(jié)鏡下相關(guān)組織大體病理變化程度的相關(guān)性。2006年3月~200

25、6年6月數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計(jì)分析，撰寫論文,論文答辯。,開題條件（1）——學(xué)術(shù)及技術(shù)條件,研究人員衛(wèi)小春教授 長期從事關(guān)節(jié)軟骨損傷的研究,具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和很強(qiáng)的科研能力.能及時(shí)把握國際上關(guān)節(jié)軟骨損傷研究的最新進(jìn)展。主持承擔(dān)國家863計(jì)劃一項(xiàng)及省部級科研項(xiàng)目多項(xiàng)，在國內(nèi)外期刊上發(fā)表論文多篇。 文獻(xiàn)和技術(shù)準(zhǔn)備已檢索并熟讀了大部分相關(guān)核心文獻(xiàn)，了解該領(lǐng)域的研究進(jìn)展、YKL-40的檢測方法。 病源及標(biāo)本來源山醫(yī)二院骨科病源充足；課

26、題所需的體液標(biāo)本較易獲得。,開題條件（2）——實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件,山醫(yī)二院所具備的實(shí)驗(yàn)條件手術(shù)室：關(guān)節(jié)鏡設(shè)備；骨科實(shí)驗(yàn)室：酶標(biāo)儀及相關(guān)波長的濾光片、深低溫冰箱、低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、電熱恒溫孵育箱、電子天平、普通冰箱；放射科：拍片相關(guān)設(shè)備。,開題條件（3）——經(jīng)費(fèi)預(yù)算,科研業(yè)務(wù)費(fèi) 3000元 實(shí)驗(yàn)材料費(fèi) 7000元 儀器設(shè)備費(fèi) 4000元 協(xié)作費(fèi)

27、 1500元 科研組織費(fèi) 2000元 合 計(jì) 17500元,參考文獻(xiàn),Poole R. NIH White Paper: Biomakers, the Osteoarthritis Initiative (A Basis for Discussion). Ferbruary 3rd,2000.Morgante M, Metelli

28、 MR, Morgante D. Observations on the increased serum levels of YKL-40 in patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Minerva Med. 2001;92(3):151-3. Johansen JS, Olee T, Price PA, et al. Regulation of YKL-40 p

29、roduction by human articular chondrocytes. Arthritis Rheum. 2001;44(4):826-37. Volck B, Johansen JS, Stoltenberg M, et al. Studies on YKL-40 in knee joints of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Invol

30、vement of YKL-40 in the joint pathology. Osteoarthritis Cartilage. 2001 ;9(3):203-14. Kawasaki M, Hasegawa Y, Kondo S, et al. Concentration and localization of YKL-40 in hip joint diseases. J Rheumatol. 2001;28(2):341-5

31、. Vos K, Steenbakkers P, Miltenburg AM, et al. Raised human cartilage glycoprotein-39 plasma levels in patients with rheumatoid arthritis and other inflammatory conditions. Ann Rheum Dis. 2000;59(7):544-8. Johansen JS,

32、 Hvolris J, Hansen M, et al. Serum YKL-40 levels in healthy children and adults. Comparison with serum and synovial fluid levels of YKL-40 in patients with osteoarthritis or trauma of the knee joint. Br J Rheumatol. 1996