骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)舌鱗癌生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、目的:
　　本研究通過平板克隆實(shí)驗(yàn)、CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)等體外實(shí)驗(yàn)探討(BMSCs)對(duì)舌鱗癌(TSCC)細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響，同時(shí)，建立TSCC裸鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型，尾靜脈注射攜帶綠色熒光蛋白標(biāo)記的BMSCs，通過測(cè)量腫瘤體積、熒光顯微鏡觀察、組織學(xué)觀察以及免疫組化染色等方法探討B(tài)MSCs在體內(nèi)向TSCC移植瘤模型組織的遷移及對(duì)移植瘤模型生物學(xué)行為的影響。
　　方法

2、：
　　1、BMSCs對(duì)舌鱗癌細(xì)胞系CAL27生物學(xué)行為的影響
　　1.1 舌鱗癌細(xì)胞系CAL27和BMSCs的共培養(yǎng)
　　培養(yǎng)舌鱗癌細(xì)胞系CAL27和BMSCs至對(duì)數(shù)生長期，舌癌細(xì)胞用1640完全培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)到2.5×105個(gè)，加入至6孔板中。BMSCs用BMSCs培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)到1.5×105個(gè)，加入到Transwell系統(tǒng)的上室中。
　　1.2 平板克隆實(shí)驗(yàn)
　　實(shí)驗(yàn)

3、分為兩組:共培養(yǎng)組和對(duì)照組。共培養(yǎng)組中，舌鱗癌細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，以每皿1×104個(gè)舌鱗癌細(xì)胞密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每2天補(bǔ)加100ul共培養(yǎng)的上清液，對(duì)照組加等量的單獨(dú)培養(yǎng)的舌癌細(xì)胞和舌癌細(xì)胞上清液。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，直接計(jì)數(shù)克隆，比較克隆形成的大小和數(shù)目。
　　1.3 CCK8增殖實(shí)驗(yàn)
　　實(shí)驗(yàn)分為兩組:共培養(yǎng)組和對(duì)照組。共培養(yǎng)組中:舌鱗癌細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，以每孔10

4、00個(gè)細(xì)胞種到96孔板中，每隔24h加20ul共培養(yǎng)的上清液;對(duì)照組加等量的單獨(dú)培養(yǎng)的舌癌細(xì)胞和舌癌細(xì)胞上清液，每隔24h檢測(cè)一次細(xì)胞活力，檢測(cè)前每孔加10ul CCK8試劑，37℃培養(yǎng)箱中孵育1.5h，使用酶標(biāo)儀用450nm激發(fā)光檢測(cè)OD值，繪制增殖曲線。
　　1.4 Transwe11遷移實(shí)驗(yàn)
　　實(shí)驗(yàn)組中將共培養(yǎng)24h的舌癌細(xì)胞1×104個(gè)加入小室中，下室中加入10％ FBS培養(yǎng)液。對(duì)照組中上室加入等量的單獨(dú)培養(yǎng)的舌癌

5、細(xì)胞，下室中加入10％ FBS培養(yǎng)液。兩組上室均使用無血清培養(yǎng)液，其他培養(yǎng)條件一致，24h后多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，切下基底膜置于載玻片上觀察，隨機(jī)選取5個(gè)清晰的視野，拍照，計(jì)數(shù)。
　　1.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)
　　將transwell小室至于24孔板中，加入稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠，水化基底膜，將共培養(yǎng)24h的細(xì)胞消化，使用無血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，每個(gè)小室中加入100ul，使細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×104個(gè)。下室

6、中加入600ul的10％FBS培養(yǎng)液;對(duì)照組中上室加入等量的單獨(dú)培養(yǎng)的舌癌細(xì)胞，下室中加入10％FBS培養(yǎng)液，保持兩組間的培養(yǎng)條件一致，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，切下基底膜置于載玻片上觀察，隨機(jī)選取5個(gè)清晰的視野，拍照，計(jì)數(shù)。
　　2、BMSCs對(duì)舌鱗癌移植瘤生物學(xué)行為的影響的體內(nèi)研究
　　2.1 舌鱗癌移植瘤模型的建立
　　本實(shí)驗(yàn)采用貼壁法培養(yǎng)人舌鱗癌細(xì)胞，當(dāng)體外擴(kuò)增的細(xì)胞量達(dá)到移植標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將細(xì)胞消化移入離心管，10

7、00rpm離心5min，棄上清液，加入DMEM高糖培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，并調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×107個(gè)/mL。5周齡健康雄性BALB/c裸小鼠，18只，適應(yīng)1周后，隨機(jī)取其中12只裸小鼠，以密度1×107個(gè)舌鱗痛細(xì)胞(注射劑量為0.2 mL)注射于每只裸鼠近左腋部皮下，每天用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量裸鼠腫瘤的長徑(a)及短徑(b)，長度單位為mm，腫瘤體積計(jì)算公式為V=1/2ab2，當(dāng)平均組內(nèi)瘤體積達(dá)到50mm3時(shí)，為達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.

8、2 BMSCs向舌鱗癌移植瘤的遷移
　　培養(yǎng)BMSCs，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80％-90％時(shí)，給細(xì)胞傳代，利用攜帶GFP基因的慢病毒載體感染BMSCs，并于體外擴(kuò)增，數(shù)量級(jí)達(dá)到移植要求。于腫瘤達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)后，取生長旺盛的GFP標(biāo)記的BMSC細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL，用1mL注射器緩慢注入TSCC+BMSC組和BMSC組小鼠尾靜脈，每只小鼠注射0.2mL。4周后處死裸鼠，解剖出腫瘤分兩份，一份置于液氮中保存，另一份用福爾馬

9、林溶液固定，做石蠟切片。
　　從液氮中取出冷凍的移植瘤組織進(jìn)行組織切片，于熒光顯微鏡下檢測(cè)GFP的表達(dá)。用Abcam公司的兔單克隆抗體GFP抗體作為一抗，按試劑盒說明書的方法對(duì)組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)GFP的表達(dá)情況。
　　2.3 BMsCs對(duì)舌鱗癌移植瘤生長的影響
　　觀察尾靜脈注射BMSCs后裸鼠腫瘤生長情況和體重變化情況，每兩天測(cè)量一次裸鼠腫瘤體積及裸鼠體重，按照文獻(xiàn)上報(bào)道的方法（V=1/2ab2，V為腫瘤體積，a為

10、長徑，b為短徑）計(jì)算腫瘤體積大小并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。并對(duì)各組腫瘤組織的分化類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　體內(nèi)免疫組化實(shí)驗(yàn)按試劑盒說明書對(duì)TSCC組、TSCC+BMSC組舌癌組織中與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的指標(biāo)Ki67，c-myc和PCNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。先進(jìn)行二甲苯脫蠟和水化，然后參照一抗說明書進(jìn)行抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加適量一抗、適量辣根酶標(biāo)羊抗兔IgG聚合物和適量DAB顯色劑，蘇木精復(fù)染后沖洗，脫水，透明，封片。用PBS代替一

11、抗作為陰性對(duì)照，無特異性染色者為陰性，細(xì)胞或組織呈特異性棕黃色染色者為陽性。對(duì)免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、BMSCs對(duì)舌鱗癌細(xì)胞系CAL27生物學(xué)行為的影響的體外研究
　　1.1 平板克隆實(shí)驗(yàn):
　　培養(yǎng)兩周后，共培養(yǎng)組的細(xì)胞克隆數(shù)目多于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033＜0.05)，說明CAL27舌癌細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)后增殖能力增加。
　　1.2 CCK8增殖實(shí)驗(yàn):<

12、br>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:共培養(yǎng)組和對(duì)照組在0h（P=0.729＞0.05）和24h(P=0.890＞0.05)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在48h（P=0.025＜0.05）和72h（P=0.004＜0.05），共培養(yǎng)組增殖高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1.3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn):共培養(yǎng)組細(xì)胞遷移到小室下表面的數(shù)量多于對(duì)照組，兩組間差異顯著（P=0.001＜0.05），說明共培養(yǎng)后，癌細(xì)胞的遷移能力變強(qiáng)。
　　1.4 T

13、ranswell侵襲實(shí)驗(yàn):在侵襲實(shí)驗(yàn)中，共培養(yǎng)組舌鱗癌細(xì)胞將基質(zhì)膠分解后運(yùn)動(dòng)到小室下表面細(xì)胞多于對(duì)照組，且差異顯著（P=0.002＜0.05），說明共培養(yǎng)后，癌細(xì)胞的侵襲能力變強(qiáng)。
　　2、BMSCs對(duì)舌鱗癌移植瘤生物學(xué)行為影響的體內(nèi)研究
　　2.1 舌鱗癌移植瘤動(dòng)物模型的建立
　　培養(yǎng)的舌鱗癌細(xì)胞高倍鏡下核異常分裂象多見，說明舌癌細(xì)胞增殖非?；钴S。于裸鼠近左腋部處皮下注射舌鱗癌細(xì)胞系CAL27后，1周后在左腋部皮下可

14、見膨隆，2周后可觸及質(zhì)硬的結(jié)節(jié)性腫塊，后腫瘤逐漸增大，裸鼠移植瘤的大小與生長時(shí)間成正比，隨時(shí)間增長而增大。3周達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)，成功建立裸鼠舌癌移植瘤動(dòng)物模型。
　　2.2 靜脈注射的BMSCs向舌鱗癌移植瘤的遷移
　　培養(yǎng)的BMSCs為均質(zhì)的、細(xì)長的、典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，呈漩渦狀生長。攜帶GFP慢病毒感染BMSCs后可觀察到綠色熒光表達(dá)，GFP隨細(xì)胞傳代穩(wěn)定表達(dá)。將BMSCs緩緩注入裸鼠尾靜脈。4周后，處死裸鼠。解剖學(xué)發(fā)現(xiàn)，

15、腫瘤包膜完整，表面光滑，與周圍組織分界清楚，與背部皮膚、肌肉組織無明顯粘連，形狀多不規(guī)則，表面結(jié)節(jié)狀，腋下及腹股溝淋巴結(jié)未見明顯腫大。
　　在熒光顯微鏡下觀察，在TSCC+BMSC組腫瘤組織中可見綠色熒光，而在TSCC組腫瘤組織中未見綠色熒光。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在TSCC+BMSC組，GFP抗體定位于腫瘤組織和肝臟組織中，未在肺臟組織中發(fā)現(xiàn)。而在未注射BMSC的TSCC組，在腫瘤組織、肝臟和肺組織中均未見GFP。說明BMSCs

16、可遷移至舌癌組織中。
　　2.3 BMSCs對(duì)舌鱗癌移植瘤生長的影響
　　注入BMSCs4周后我們發(fā)現(xiàn):BMSC組裸鼠體重增加明顯，TSCC組次之，BMSC+TSCC組裸鼠體重增加不明顯，BMSC+TSCC組和TSCC組裸鼠體重增加無顯著差異（P＞0.05）。移植BMSCs后的前15天，腫瘤大小無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），從第16天開始，BMSC+TSCC組腫瘤增長較快，較TSCC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明B

17、MSCs促進(jìn)舌癌生長。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)Ki67，c-myc和PCNA表達(dá)在TSCC細(xì)胞核中，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，TSCC+BMSCs組表達(dá)較TSCC組強(qiáng)（P＜0.05）。說明BMSCs促進(jìn)舌癌細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論:
　　1、成功建立舌鱗癌動(dòng)物模型。
　　在CAL27舌鱗癌細(xì)胞接種量、接種部位、動(dòng)物周齡及狀態(tài)等內(nèi)外部條件適宜情況下，成瘤率可達(dá)100％。
　　2、BMSCs能促進(jìn)舌癌細(xì)胞遷移并且能遷移至舌癌組織中。