小麥體細(xì)胞雜交中外源染色質(zhì)的消減與漸滲研究.pdf

1、體細(xì)胞雜交技術(shù)能夠克服有性雜交不親和等障礙，產(chǎn)生多種多樣的有性雜交無法實(shí)現(xiàn)的作物新類型。目前，體細(xì)胞雜交育種已在多種植物中獲得成功。本實(shí)驗(yàn)室成功的進(jìn)行了小麥與多種禾草的體細(xì)胞雜交，并在小麥與長穗偃麥草的對稱與不對稱體細(xì)胞雜交中分別獲得了長穗偃麥草/小麥漸滲系和小麥/長穗偃麥草漸滲系。通過對小麥/長穗偃麥草漸滲系的篩選培養(yǎng)，從其后代中選育出一系列耐鹽、耐旱新品種和高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的小麥新品系。對小麥體細(xì)胞雜交機(jī)制進(jìn)行深入研究將有助于體細(xì)胞雜交技

2、術(shù)在小麥育種中的應(yīng)用，但是目前尚無相關(guān)報道。本實(shí)驗(yàn)對小麥體細(xì)胞雜交早期供體染色質(zhì)消減與漸滲機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，闡明了小麥體細(xì)胞雜種中供體染色質(zhì)消減的時期及方式，探討了供體與小麥親緣關(guān)系及射線劑量對小麥體細(xì)胞雜種中供體染色質(zhì)消減和漸滲的影響；通過混合小麥與兩種不同親緣關(guān)系供體的對稱體細(xì)胞雜交，首次獲得了小麥與早熟禾的體細(xì)胞雜種，揭示了小麥雜種的植株再生與親本染色質(zhì)互補(bǔ)現(xiàn)象，并探討了組織培養(yǎng)及雜交過程中的甲基化模式變化。此外，通過對小麥與

3、長穗偃麥草的偏草型雜種及后代的分析，闡明了雜種小麥染色體的存在方式；探討了雜種中小麥染色體的消減現(xiàn)象。 主要研究結(jié)果如下： 1 小麥體細(xì)胞雜交早期雜種細(xì)胞中供體染色質(zhì)的消減方式 小麥與四種禾草(長穗假麥草Agropyronelongatum(Host)Neviski、簇毛麥HaynaldiavillosaL.、早熟禾PoaannuaL.、玉米ZeamaysL.)體細(xì)胞雜交早期融合材料的GISH分析表明：雜種中供體

4、染色質(zhì)主要以微核的形式在細(xì)胞間期發(fā)生消減，同時還存在少量其它的消減方式，如有絲分裂后期形成微核、多核體中形成微核以及雙親核分離等現(xiàn)象。此外，在簇毛麥的體細(xì)胞雜種中發(fā)現(xiàn)供體染色質(zhì)以落后染色體及染色體橋的形式存在。分析發(fā)現(xiàn)雙親核分離的現(xiàn)象主要出現(xiàn)在小麥與遠(yuǎn)緣禾草早熟禾和玉米的雜交組合5-7天的材料中，而在近緣禾草與小麥的雜交中很少出現(xiàn)，表明親緣關(guān)系對小麥體細(xì)胞雜交中供體染色質(zhì)的消減具有明顯的影響。 2 小麥體細(xì)胞雜交早期雜種細(xì)胞中供

5、體染色質(zhì)消減與漸滲發(fā)生的主要時期 小麥與簇毛麥及早熟禾γ-ray不對稱體細(xì)胞雜交分析發(fā)現(xiàn)：雜交后5-7天供體染色質(zhì)的消減率與漸滲率明顯高于雜交后30天；融合后30天供體染色質(zhì)的消減率與漸滲率均低于10％。由此可見，小麥體細(xì)胞雜交過程中供體染色質(zhì)消減與漸滲主要發(fā)生在雜交后30天以內(nèi)，尤其是雜交后5-7天。此外，在小麥與四種禾草的對稱與UV不對稱體細(xì)胞雜交中，雜交后5-7天供體染色質(zhì)的漸滲率與消減率均明顯高于12-15天，這進(jìn)一步表

6、明小麥體細(xì)胞雜交中供體染色質(zhì)的消減與漸滲主要發(fā)生在雜交早期。 3 供體與小麥的親緣關(guān)系對小麥體細(xì)胞雜交早期雜種細(xì)胞中供體染色質(zhì)消減與漸滲的影響 通過對小麥與近緣禾草長穗偃麥草、簇毛麥以及遠(yuǎn)緣禾草早熟禾、玉米的對稱與不對稱體細(xì)胞雜交(UV1min和UV2min)的比較分析發(fā)現(xiàn)，供體與小麥的親緣關(guān)系對供體染色質(zhì)的漸滲率具有非常明顯的影響。親緣關(guān)系近，則雜種中供體染色質(zhì)的漸滲率高；親緣關(guān)系遠(yuǎn)，則雜種中供體染色質(zhì)的漸滲率低。此外

7、，供體與小麥的親緣關(guān)系與雜種中供體染色質(zhì)的消減率的變化也具有一定的規(guī)律性：親緣關(guān)系近，則雜種中供體染色質(zhì)的消減率低；親緣關(guān)系遠(yuǎn)，則雜種中供體染色質(zhì)的消減率高。但是在長穗假麥草的組合中供體染色質(zhì)的消減率均很高，如UV1min的劑量組合中，5-7天的消減率為50.4％，12-15天的為37.2％，明顯高于簇毛麥的消減率(37.0％和22.7％)。這表明：近緣供體的倍性及染色體組的大小也可以影響小麥體細(xì)胞雜交中供體染色質(zhì)的消減率。 4

8、 射線劑量對小麥體細(xì)胞雜交早期雜種細(xì)胞中供體染色質(zhì)的消減與漸滲的影響 通過對小麥與四種禾草不對稱體細(xì)胞雜交中供體染色質(zhì)消減與漸滲的比較分析表明：小麥體細(xì)胞雜交中供體染色質(zhì)的消減與漸滲受射線劑量的影響。在一定的劑量范圍內(nèi)，供體染色質(zhì)的漸滲率隨著射線劑量的增加而升高，供體染色質(zhì)的消減率隨射線劑量的增加而降低。當(dāng)射線劑量超出一定范圍時，如早熟禾γ-ray不對稱雜交10000rad劑量組合中，隨著射線劑量的增加，供體染色質(zhì)的漸滲率明顯降

9、低，而消減率大幅升高。 5 供體與小麥的親緣關(guān)系對混合小麥體細(xì)胞雜種不對稱程度的影響 混合小麥(cha9和176)與簇毛麥及早熟禾的對稱體細(xì)胞雜交獲得了不對稱程度不同的體細(xì)胞雜種，并再生大量雜種植株。對兩個組合體細(xì)胞雜種的GISH分析表明：小麥/簇毛麥體細(xì)胞雜種中，簇毛麥染色體主要以整條的形式存在，同時有1-2個簇毛麥染色體片段：而小麥/早熟禾的體細(xì)胞雜種中，沒有發(fā)現(xiàn)早熟禾的整條染色體，其染色質(zhì)呈點(diǎn)狀散布在雜種染色體上。

10、小麥/早熟禾體細(xì)胞雜種的不對稱性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于小麥/簇毛麥體細(xì)胞雜種。由此可見，供體與小麥親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，小麥體細(xì)胞雜種的不對稱程度越高。 6 體細(xì)胞雜種再生與親本染色質(zhì)的互補(bǔ) 以含有18S-5.8S-26SrDNA特異序列的pTa71質(zhì)粒為探針，對同一基因型的愈傷組織(濟(jì)南177)和懸浮細(xì)胞系(cha9)混合小麥親本及體細(xì)胞雜種進(jìn)行了FISH分析。首次發(fā)現(xiàn)了混合小麥中不同的NORs區(qū)：cha9保留了親本小麥中5條染色體上的5個

11、信號，而176僅保留了2條染色體上的2個信號；cha9和176各自含有小麥濟(jì)南177所沒有的特異NORs區(qū)信號。在早熟禾雜種16H中檢測到混合小麥各自特異的NORs區(qū)信號，直觀的揭示了混合小麥在雜種染色體組成上的互補(bǔ)現(xiàn)象。通過對雜種NORs區(qū)信號及雜種表型的分析表明雜種存在明顯的混合小麥再生互補(bǔ)現(xiàn)象。核基因組SSR分析也證實(shí)了這一點(diǎn)?；旌闲←溂霸缡旌腆w細(xì)胞雜種4H的MSAP分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過長期的繼代培養(yǎng)，混合小麥發(fā)生了大量的甲基化模式改變

12、，有大量位點(diǎn)發(fā)生甲基化。雜種植株再生過程中也有甲基化模式的改變，但明顯低于混合小麥。表明甲基化模式變化與組織培養(yǎng)的時間有關(guān)。雜種4H愈傷組織與cha9和176相比，甲基化模式變化明顯不同。與小麥177相比，雜種植株再生時，體細(xì)胞雜種中甲基化模式變化得到了明顯的恢復(fù)，包括5.88％的甲基化位點(diǎn)和3.35％的去甲基化位點(diǎn)，表明體細(xì)胞雜交中的再生互補(bǔ)與表觀遺傳變化相關(guān)。 7 對稱體細(xì)胞雜交中小麥染色體的消減與漸滲 染色體分析發(fā)

13、現(xiàn)小麥與長穗偃麥草偏草型體細(xì)胞雜種染色體數(shù)目與長穗偃麥草類似，對R0粗雜種植株部分PMC的GISH及FISH分析發(fā)現(xiàn)：小麥染色體在減數(shù)分裂末期Ⅰ時，明顯滯后，停留在赤道板上，與長穗假麥草分離；R2代PMC中僅檢測到3-5個小麥染色體小片段。這表明小麥染色體在雜種進(jìn)入有性世代或減數(shù)分裂過程中大量消減，并在消減的過程中與長穗偃麥草染色體發(fā)生重組，最終以染色體小片段的方式漸滲進(jìn)雜種中。對小麥與長穗偃麥草偏草型體細(xì)胞雜種的AFLP分析發(fā)現(xiàn)，在R

14、2代雜種中，絕大多數(shù)小麥的基因組發(fā)生消減，在兩個雜種中僅檢測到13條小麥特異條帶，其中9條在雜種中共存，1條僅在粗系雜種存在，其余3條僅在細(xì)系雜種中存在；兩個雜種中長穗偃麥草基因組消減頻率分別為9.8％及13.4％。此外，在兩個雜種中還檢測到19條新帶，其中三條僅在細(xì)系雜種中出現(xiàn)。這表明體細(xì)胞雜種中雙親基因組均發(fā)生了消減，同時伴隨著基因組的重排。對雙親及R1-R3代部分雜種種子進(jìn)行的HMW-GS分析發(fā)現(xiàn)，雜種后代的HMW-GS帶型主要偏