小麥與柴胡的體細胞雜交及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的gai基因轉(zhuǎn)化小麥.pdf

1、本文利用PEG方法進行核生3號小麥與柴胡對稱體細胞雜交及農(nóng)桿菌介導(dǎo)gai矮桿基因苗端轉(zhuǎn)化核生3號小麥。主要研究過程及實驗結(jié)果如下： 以懸浮培養(yǎng)細胞來源的柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)原生質(zhì)體，與核生3號小麥(Triticumaestivum)愈傷組織來源的原生質(zhì)體用PEG法誘導(dǎo)融合。由于來源材料的長期繼代，柴胡原生質(zhì)體的再生能力已經(jīng)喪失，核生3號小麥原生質(zhì)體的分化能力也很低，而融合產(chǎn)物卻能

2、再生。根據(jù)植物體細胞雜種具有優(yōu)先生長的特性，將再生的直徑為1.5～2mm小愈傷組織轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基(附加1mg/l2，4-D的MB培養(yǎng)基)，直徑為3.5～4mm愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(0.5mg/lIAA+1mg/l6-BA的MB培養(yǎng)基)中。再生的愈傷組織為黃白色顆粒狀，外形類似柴胡。在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.5～2個月后，80個再生細胞系中有35個細胞系分化出綠色愈傷，其中16個細胞系有綠色小芽、小葉分化，沒有完整植株再生。再生的綠色愈傷、

3、綠色小芽、小葉揉捻時產(chǎn)生的汁液有中草藥特殊氣味，小芽、小葉外形類似柴胡。 對80個再生細胞系經(jīng)酯酶同工酶篩選，RAPD、5srDNA間隔序列分析、染色體數(shù)目分析，其中16個細胞系為雜種細胞系，雜種細胞系的電泳譜帶有雙親特征帶或新帶出現(xiàn)。小麥與柴胡染色體大小區(qū)別很明顯，經(jīng)染色體數(shù)目分析顯示，雜種細胞中的染色體數(shù)目介于12～20之間，雜種細胞中柴胡的染色體數(shù)目保持完整，為12條較小的染色體，附加有1～8條明顯的來源于小麥的大染色體。

4、說明雜種中小麥的染色體可被柴胡排斥。推測，柴胡中可能存在著嚴重影響另一融合親本遺傳穩(wěn)定性的特殊物質(zhì)，值得進一步研究。 植株高度與體內(nèi)赤霉素(GA)的生物合成及轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系密切。阻斷植物體內(nèi)GA合成或轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑都可降低植株的高度，但前者可通過施加外源GAs使植株的高度得以恢復(fù)。擬南芥中野生型GAI基因編碼的GAI蛋白是赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負調(diào)節(jié)因子，它的突變型gai基因編碼的蛋白通過在DELLA區(qū)域近氨基端17個氨基酸的缺失，而不受GA

5、信號調(diào)控。本實驗所用質(zhì)粒含有g(shù)ai基因。 植物苗端轉(zhuǎn)化法是一種改良的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法，是以農(nóng)桿菌直接侵染活體植株的生長點部位，克服了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化愈傷組織時易發(fā)生體細胞無性系變異、轉(zhuǎn)化頻率低、受基因型的影響大、植株再生困難、難以結(jié)實等缺點。 本實驗先將gai基因轉(zhuǎn)入能高效轉(zhuǎn)化小麥的農(nóng)桿菌菌株AGL1中后進行苗端轉(zhuǎn)化。證明農(nóng)桿菌培養(yǎng)狀態(tài)在OD600為0.6、弱光潮濕恢復(fù)培養(yǎng)條件更適于苗端轉(zhuǎn)化實驗。對轉(zhuǎn)化植株進行PCR檢測，初步篩