暗紋東方鲀TLRs和SOD基因的分子特征與免疫應(yīng)答的初步研究.pdf

1、暗紋東方鲀是一種典型的溯河洄游性魚類，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前對(duì)暗紋東方鲀的研究主要集中在生長發(fā)育、鹽度適應(yīng)、洄游習(xí)性等方面，對(duì)其免疫相關(guān)基因和抗病因子應(yīng)對(duì)病菌感染的免疫應(yīng)答機(jī)制研究少有報(bào)道。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為一類最重要的模式識(shí)別受體(germline-encoded pattern recognition receptors，PRRs)，其主要通過識(shí)別和結(jié)合保守的病原體相關(guān)分子模式(

2、pathogen-associated molecular Patterns，PAMPs)以激活先天免疫應(yīng)答，在抵御外界病原入侵的過程中扮演重要角色。而超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)作為一種較為重要的抗氧化物金屬酶，在生物體中起到了保護(hù)機(jī)體免受超氧陰離子損傷的作用。本文以暗紋東方鲀?yōu)檠芯繉?duì)象，研究了暗紋東方鲀TLRs和SOD基因在嗜水氣單胞菌或LPS刺激下的表達(dá)變化規(guī)律，為進(jìn)一步探究暗紋東方鲀先天性免

3、疫應(yīng)答的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。具體研究結(jié)果如下:
　　(1)暗紋東方鲀TLRs基因的分子特征與免疫應(yīng)答初步分析
　　通過同源比對(duì)以及RACE技術(shù)成功克隆出暗紋東方鲀TLR2、TLR7和TLR21的基因cDNA全長序列分別為3666bp、3359bp和3259bp;預(yù)測(cè)其包括開放閱讀框(ORF)分別為2616bp、3144bp和2898bp，分別編碼871、1047和965個(gè)氨基酸;其5'UTR分別為85bp、47bp和10

4、4bp，3'UTR區(qū)分別為965bp、168bp、257bp。TLR2和TLR7基因的3'UTR區(qū)均具有典型的加尾信號(hào)AATAAA和1個(gè)mRNA不穩(wěn)定信號(hào)ATTTA，TLR21基因僅具有1個(gè)mRNA不穩(wěn)定信號(hào)ATTTA。氨基酸序列分析表明TfTLR2、TfTLR7和TfTLR21均包含TLRs家族4個(gè)典型的結(jié)構(gòu)，分別是信號(hào)肽、胞外LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)TIR結(jié)構(gòu)域。同源性比對(duì)顯示暗紋東方鲀TLR2、TLR7和TLR21氨基酸序列與

5、其它物種的同源性分別在25-98％、54-99％和40-99％之間，其中與同為東方鲀屬的紅鰭東方鲀同源性最高。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明這3個(gè)TLRs基因在魚類中高度保守。
　　通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TLR2、TLR7和TLR21基因在暗紋東方鲀不同組織中的表達(dá)分布，結(jié)果顯示，這3個(gè)TLRs基因在肝、腎、肌肉、腦、脾、鰓、腸、心臟8個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在免疫相關(guān)組織肝、腎和脾中表達(dá)量均較高。對(duì)嗜水氣單胞菌或LPS注射處理下的暗紋東方

6、鲀肝、腎和脾3種組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TfTLR2、TfTLR7和TfTLR21基因的mRNA表達(dá)量在病菌注射組中均顯著差異表達(dá)(P＜0.05)。通過Western Blot技術(shù)，分析了肝組織TfTLR2和脾組織TfTLR7蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)TfTLRs蛋白的表達(dá)量在病菌感染下均顯著上調(diào)(P＜0.05）。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于LPS感染，嗜水氣單胞菌感染能夠更快使暗紋東方鲀產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　(2)暗紋東方鲀SOD基因的

7、表達(dá)分析
　　通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)MnSOD和Cu/ZnSOD基因在暗紋東方鲀不同組織中的表達(dá)分布，結(jié)果顯示，這2個(gè)SOD基因在暗紋東方鲀肝、腎、肌肉、腦、脾、鰓、腸、心臟8個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在肝組織表達(dá)量均最高，其次是心臟和腦，在其它組織中的表達(dá)量均非常低。對(duì)嗜水氣單胞菌或LPS注射處理下的暗紋東方鲀肝、腎和鰓3種組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)SOD基因的mRNA、酶活以及蛋白在病菌感染下均發(fā)生了顯著差異表達(dá)(P＜0.05）