金錢魚MHCI類基因結(jié)構(gòu)、多態(tài)性與組織表達分析及其線粒體基因組全序列分析.pdf

1、以金錢魚為對象，利用RACE-PCR技術(shù)，克隆獲得其主要組織相容性復(fù)合體I類α基因（Major histocompatibility complex，MHC Iα）和β2m微球蛋白（β2m-microglobulin）基因的全長序列，并分析其基因結(jié)構(gòu)、組織表達情況及MHC Iα的多態(tài)性；然后，運用間隔PCR法，獲得了金錢魚的線粒體基因組全長序列。這些研究結(jié)果，既為今后探討MHC基因多態(tài)性和抗病性的關(guān)系積累了基礎(chǔ)資料，又豐富了魚類的線粒體

2、基因庫。論文的主要研究結(jié)果如下：
　　1金錢魚 MHC Iα基因結(jié)構(gòu)及組織表達分析
　　運用RACE技術(shù)，首次成功克隆獲得長度為2020bp的金錢魚MHC Iα基因的cDNA全長序列。該基因的開放閱讀框（Opening reading frame，ORF）長1068 bp，編碼一個分子量為40.09 KDa并由356個氨基酸組成的前體蛋白，其第1~19位為信號肽（SP）；5’非編碼區(qū)（5’-Untranslated Regi

3、on，UTR）為86bp；3’UTR為866bp，含有典型的多聚腺苷酸加尾信號AATAAA及Poly A尾巴。分析表明：該序列含有經(jīng)典的MHC Iα基因結(jié)構(gòu)，如N-糖基化位點、N豆蔻?；稽c、蛋白激酶C磷酸化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點、cAMP-與cGMP-依賴的蛋白激酶磷酸化位點和保守的半胱氨酸殘基（C），在第204～278形成一個免疫球蛋白樣區(qū)（Immunoglobulin-1ike region，IG-L

4、IKE）。金錢魚MHC Iα分子為混合型蛋白，其中α螺旋（H）為23.4％，β片層（E）占28.5%，無規(guī)卷曲及β轉(zhuǎn)角占48.2%。對其氨基酸序列分析得知：金錢魚MHC Iα基因的與金頭鯛的相似率達70%，與鱸的相似率為68%，而與鮭鱒類、兩棲類、鳥類、哺乳類的相似率則依次降低。金錢魚MHC Iα基因含有6個內(nèi)含子和7個外顯子，其內(nèi)含子片段的長度分別為541bp、335bp、446bp、655bp/691bp、433bp、300bp；內(nèi)

5、含子4在同一個體中擴增出兩種不同長度類型，顯示出長度多態(tài)性，而內(nèi)含子6卻將3’-UTR區(qū)隔開，且所有內(nèi)含子與外顯子進行匹配的位點均為gt/ag。用熒光定量PCR法，檢測金錢魚MHC Iα基因在不同組織中的表達情況，結(jié)果顯示，該基因在腎和脾等免疫組織中表達量較高，中等表達于胃、肝、心、腦和眼睛，而在鰓、肌肉、腸等組織中的表達較弱。
　　2金錢魚MHC Iα的多態(tài)性
　　從42尾金錢魚的210個有效克隆中，獲得長度為1065~1

6、074bp的不同核苷酸序列208條，共編碼163條不同的氨基酸序列，這些序列都包含完整的SP，α1、α2和α3結(jié)構(gòu)域，連接肽、跨膜區(qū)及胞質(zhì)區(qū)。參照之前的等位基因命名規(guī)則，可歸為20個等位基因主型及135個等位基因亞型，分別命名為 Scar-UA*0101~Scar-UA*2001。分析顯示，金錢魚MHC Iα基因的核苷酸與氨基酸序列的變異率分別為53.22%、70.22%；其α1和α2結(jié)構(gòu)域的抗原肽結(jié)合區(qū)（PBR）的同義替換率與非同義替

7、換率的比值ω（ω=dN/dS）均大于1，而其非抗原肽結(jié)合區(qū)（non-PBR）、總結(jié)構(gòu)域及α3結(jié)構(gòu)域的ω值都小于1，說明α1和α2結(jié)構(gòu)域在進化過程中受到正向選擇作用。運用 NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹中，金錢魚首先與鱸聚為一支，而與虹鱒、金頭鯛、鯉和斑馬魚的親緣關(guān)系相對較遠。
　　3金錢魚β2m的基因結(jié)構(gòu)及組織表達分析
　　金錢魚β2m基因的cDNA全長為905bp，預(yù)測編碼116個氨基酸。它的ORF長351 bp，5’ UTR長8

8、7bp；3’UTR為467bp，并含有典型的多聚腺苷酸加尾信號AATAAA及Poly A尾巴。金錢魚β2m基因的氨基酸序列的分子量為13.01 kDa，等電點為8.38，信號肽為第1~15個氨基酸，而酶切后的成熟蛋白長101個氨基酸，含有1個N-豆蔻?；稽c、2個蛋白激酶C-磷酸化位點、1個酪氨酸激酶II磷酸化位點和一個免疫球蛋白樣區(qū)與主要組織相容性復(fù)合體的信號識別位點等不同的功能位點；β2m分子同樣為混合型蛋白，其α螺旋（H）占9.

9、5%，β片層（E）占37.9%，無規(guī)卷曲及β轉(zhuǎn)角占52.6%。分析顯示，金錢魚β2m分子與大黃魚的相似率高達78%，與鱸的相似率高達68%，而與鮭鱒魚類、鯉科魚類、兩棲類、鳥類和哺乳類的親緣關(guān)系則漸遠。金錢魚β2m基因含有2個內(nèi)含子和3個外顯子，其內(nèi)含子片段的長度分別為944bp和279bp，且所有的內(nèi)含子與外顯子進行匹配的位點均為gt/ag。采用熒光定量PCR法，對金錢魚β2m基因在十個正常組織的不同表達量進行定量分析得知：在腎、脾、

10、腸、肝和腦中表達量很高，中等表達于心、鰓、胃和眼中，肌肉中表達量最低。
　　4金錢魚的線粒體基因組全序列
　　利用間隔PCR法，擴增獲得金錢魚的線粒體基因組全序列。該線粒體基因組全長為16783 bp（GenBank登錄號：KC790398），為環(huán)狀雙鏈 DNA，主要包括22個tRNA基因、13個蛋白質(zhì)編碼基因、2個rRNA基因及1個非編碼控制區(qū)（D-loop區(qū)）；8個tRNA和ND6均位于輕鏈，其余基因和D-loop區(qū)則位