半滑舌鰨piwil2和pik3r1基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、作為我國(guó)北方地區(qū)主要的人工養(yǎng)殖海水魚類之一,半滑舌鰨以肉質(zhì)鮮美聞名,的產(chǎn)量及市場(chǎng)需求量逐年增加。然而在自然條件下,雄性個(gè)體的發(fā)育遠(yuǎn)滯后于雌性,影響受精卵質(zhì)量和數(shù)量。因而,從基因水平研究半滑舌鰨精子發(fā)生過程,對(duì)提高雄魚精子質(zhì)量,大規(guī)模培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)苗種,推動(dòng)半滑舌鰨人工養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有重大意義。
　　根據(jù)全基因組測(cè)序獲得的部分序列信息,本研究對(duì)半滑舌鰨piwil2基因進(jìn)行了cDNA全長(zhǎng)克隆,表達(dá)分析,啟動(dòng)子甲基化水平檢測(cè)及染色體定位。

2、Piwil2基因全長(zhǎng)3314bp,包括3’UTR92bp,5’UTR60bp,一個(gè)3162bp的開放閱讀框(ORF),其編碼的PIWIL2蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為117kDa,理論等電點(diǎn)為8.81,由1053個(gè)氨基酸殘基組成。經(jīng)預(yù)測(cè)分析, PIWIL2蛋白含有典型的piwi結(jié)構(gòu)域和PAZ結(jié)構(gòu)域,無信號(hào)肽位點(diǎn),是Argonaute蛋白家族,Piwi亞家族的一員。RT-qPCR結(jié)果顯示,在性成熟雌性、雄性半滑舌鰨的11種組織中,piwil2基因只

3、在其性腺中特異表達(dá),且精巢中的表達(dá)量明顯高于卵巢。而在半滑舌鰨雌、雄仔魚的性腺中,出膜后20天至80天時(shí)均檢測(cè)不到piwil2基因表達(dá)。自出膜后95天起,piwil2基因才開始大量表達(dá),且精巢的表達(dá)量顯著高于卵巢。經(jīng)染色體定位,確定了piwil2基因是位于半滑舌鰨的Z染色體上。由此可見,piwil2基因不是半滑舌鰨的性別分化的相關(guān)基因,但是在半滑舌鰨雄魚的精子發(fā)生過程起重要作用。以性腺DNA為模板,利用亞硫酸氫鈉測(cè)序法(bisulfit

4、e-sequencing PCR, BSP),本研究分別檢測(cè)了雄魚、雌魚、偽雄魚性腺中piwil2基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平。結(jié)果顯示,雄魚、偽雄魚精巢的piwil2基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平均顯著低于雌魚卵巢。由此可知,piwil2基因在雌雄魚性腺中的表達(dá)差異是由其啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的差異導(dǎo)致的。
　　以半滑舌鰨性腺cDNA為模板,通過序列驗(yàn)證及RACE末端擴(kuò)增,本文成功拼接獲得一個(gè)生殖干細(xì)胞分裂調(diào)控基因pik3r1。該基因全長(zhǎng)

5、2443bp,其中3’UTR長(zhǎng)116bp,5’UTR長(zhǎng)173bp,一個(gè)完整的開放閱讀框2154bp,編碼717個(gè)氨基酸殘基,編碼產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量81.7kDa,理論等電點(diǎn)為5.88。不同發(fā)育時(shí)期的生理組織學(xué)切片及RT-PCR結(jié)果表明,該批半滑舌鰨雄魚從95d開始進(jìn)入精子發(fā)生時(shí)期,pik3r1基因的表達(dá)量持續(xù)增加。對(duì)成魚不同組織的熒光實(shí)時(shí)定量結(jié)果顯示,pik3r1基因在成魚性腺中的表達(dá)量顯著高于其他組織,且精巢的表達(dá)量明顯高于卵巢,說明p