沉默Piwil2表達對子宮頸癌細胞增殖和衰老的影響.pdf

1、研究背景：
　　宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)第一位的惡性腫瘤，全球每年大約有500，000名新發(fā)病例，其中80％在發(fā)展中國家，我國每年大約有10000名新發(fā)病例，且近年來有年輕化趨勢，高危型HPV16、18感染作為宮頸癌的啟動因素對于促進癌癥的發(fā)展有至關(guān)重要的作用。目前手術(shù)和放、化療是宮頸癌主要的治療手段，但并發(fā)癥、副作用、轉(zhuǎn)移、復發(fā)和耐藥等使其具有局限性，迫切需要一種更為有效的治療方法來提高療效，以期達到治愈宮頸癌的目的。近年來隨著腫瘤

2、干細胞的研究，證實腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥和復發(fā)的根源，因此尋找一種特異性表達在腫瘤干細胞中的基因作為靶點會為宮頸癌的治療帶來突破。
　　腫瘤干細胞的形成與發(fā)展主要與多種干胚胎基因、生殖干細胞基因和成體干細胞基因的是否重表達有關(guān)。雖然胚胎干細胞相關(guān)基因如POU5f1（Oct-4)，Nanog，Lin28B，c-Myc和Sox2等可表達在腫瘤干細胞中，但其表達并不穩(wěn)定且具有爭議性，而生殖干細胞相關(guān)基因如 Piwil2可穩(wěn)定表

3、達在各種腫瘤的腫瘤干細胞中，同時Piwil2可促進原癌基因或胚胎干細胞基因如c-Myc、Lin28B、Sox2等的表達并在腫瘤干細胞多步驟演變與分化中有重要作用，因此其可能作為腫瘤檢測、診斷、治療的一個重要標記物。
　　Piwil2蛋白是AGO/PIWI蛋白家族的一種，正常情況下只表達在睪丸組織中，對于維持生殖干細胞的發(fā)育和配子的形成具有重要的作用。同時 Piwil2蛋白可特異性表達在多種腫瘤組織和細胞系的腫瘤干細胞，從而使腫瘤干

4、細胞具有自我更新和不斷增殖等異常的表觀遺傳特性和惡性轉(zhuǎn)化能力，有利于腫瘤的形成。
　　細胞衰老是細胞受體內(nèi)外多種因素的影響導致DNA斷裂損傷、氧自由基累積、端粒縮短等致使生長代謝不可逆性停止的現(xiàn)象。主要受細胞色素依賴激酶抑制家族如 P16基因調(diào)控，導致相應(yīng)的端粒長度縮短及端粒酶活性降低等即細胞發(fā)生衰老，其中端粒的長度維持主要是由端粒逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT決定。在多種腫瘤中P16的表達常缺如而hTERT的活性增高，而恢復P16表達的增加

5、可抑制hTERT的表達。
　　目的：
　　沉默宮頸癌細胞中Piwil2基因的表達，觀察其對細胞增殖和衰老等生物學特性的影響，并進一步探討其相關(guān)的分子學機制。
　　方法：
　?。?）Sh-piwil2質(zhì)粒采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染宮頸癌C33A和Hela細胞株，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株 C33A-shPiwil2和HeLa-shPiwil2，沉默Piwil2基因的表達；熒光顯微鏡鏡檢、Q-

6、PCR和Western blot方法檢測Piwil2沉默效果。
　?。?）采用細胞增殖實驗檢測細胞增殖，集落形成實驗觀察細胞克隆形成能力。
　　（3）采用流式細胞周期檢測技術(shù)分析Piwil2沉默前后細胞周期分布的變化。
　?。?）采用β-半乳糖苷酶染色法檢測沉默Piwil2基因?qū)毎ダ系挠绊憽?br>　?。?）運用Q-PCR和Western blot方法檢測沉默Piwil2對P16和hTERT表達的影響。
　　

7、結(jié)果：
　?。?）建立C33A-shPiwil2和Hela-shPiwil2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株；Q-PCR與Western blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組Piwil2 mRNA與蛋白的表達水平均顯著降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　?。?）細胞增殖實驗與集落形成實驗均證明：與對照組相比，沉默Piwil2組細胞生
　　長顯著抑制，集落形成能力下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（3）細胞周期檢測結(jié)

8、果顯示：與對照組相比Piwil2沉默后細胞的G0/G1期比例增加，S期比例減少，組間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　?。?）β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示：沉默 Piwil2組細胞衰老比例顯著增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　?。?）Q-PCR與Western blot檢測P16和hTERT表達：與對照組相比，Piwil2沉默后細胞P16表達上升，而hTERT的表達下降（P<0.05）。
　　結(jié)