子宮頸癌細(xì)胞中Src對(duì)ERK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：
　　子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與信號(hào)通路中相關(guān)因子的異常表達(dá)有關(guān)。Src作為重要的信號(hào)因子，在多種組織類型的人類實(shí)體瘤中被激活和（或）蛋白表達(dá)過量。有研究表明， p-Src在子宮頸癌組織及細(xì)胞系中過度表達(dá)，并影響著疾病的進(jìn)展和預(yù)后。ERK信號(hào)通路廣泛參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，但在子宮頸癌細(xì)胞中Src對(duì)ERK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本次研究采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法，以ERK信號(hào)通路關(guān)鍵因子Src、ERK1/2、c-Fos、

2、c-Jun以及核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子hnRNP E1作為靶點(diǎn)，施加Src抑制劑干預(yù)，檢測(cè)Src對(duì)其表達(dá)的影響及其與子宮頸癌細(xì)胞的關(guān)系，以此綜合評(píng)價(jià)Src對(duì)子宮頸癌細(xì)胞中ERK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，為深入了解和認(rèn)識(shí)子宮頸病變過程并尋找可能的干預(yù)途徑提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　選取子宮頸癌Hela細(xì)胞（HPV+）和C33A細(xì)胞（HPV-）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。采用PP2對(duì)兩種細(xì)胞的Src激酶施加干預(yù)，確定PP2的最佳抑制濃度（IC50）和抑制

3、時(shí)點(diǎn)。設(shè)立Src抑制前組為對(duì)照組，Src抑制后組為實(shí)驗(yàn)組。采用活細(xì)胞計(jì)數(shù)法和CCK-8法測(cè)定抑制前后兩種細(xì)胞的生長情況和細(xì)胞活性，行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的周期和及凋亡情況，分別采用Real-time PCR和Western-blot法檢測(cè)Src、ERK1/2、c-Fos、c-Jun、hnRNP E1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。數(shù)據(jù)的錄入和分析由SPSS17.0軟件執(zhí)行。
　　結(jié)果：
　　1. PP2抑制效果的評(píng)價(jià)：（1）最佳

4、抑制條件：傳代后24h，20μM的PP2作用于Hela細(xì)胞，傳代后24h，12μM的PP2作用于C33A細(xì)胞。（2）PP2抑制效果的評(píng)價(jià)：PP2明顯下調(diào)了兩種子宮頸癌細(xì)胞的p-Src蛋白水平，說明采用以上抑制條件，很好地達(dá)到了抑制效果。其中，Hela細(xì)胞的p-Src蛋白較抑制前下降了28.87％（t=4.547,P=0.045），C33A細(xì)胞的p-Src蛋白較抑制前下降了33.33%（t=5.354, P=0.033）。同時(shí)，Hela細(xì)

5、胞的Src蛋白降低了33.56%（t=1.662, P=0.238），C33A細(xì)胞的Src蛋白降低了29.47%（t=3.233, P=0.082）。經(jīng)比較，p-Src蛋白和Src蛋白抑制前后的降低值在C33A和Hela間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-0.139, P=0.893;t=-1.869, P=0.099）。（3）Src抑制后，兩種子宮頸癌細(xì)胞的Src mRNA含量較抑制前升高（ t=-1.137, P=0.306;t=-18.403,

6、 P=0.003），且Hela細(xì)胞的Src mRNA升高值顯著大于C33A細(xì)胞（t=13.909, P<0.001）。
　　2．Src對(duì)子宮頸癌細(xì)胞一般生物學(xué)特性的影響:（1）Src影響細(xì)胞活性。Src抑制前，C33A細(xì)胞和Hela細(xì)胞迅速繁殖，C33A的生長速度慢于Hela。Src抑制后，兩種細(xì)胞生長速度變慢，活細(xì)胞數(shù)大量減少（P<0.001），最佳抑制條件下，各時(shí)點(diǎn)的PP2對(duì)C33A細(xì)胞和Hela細(xì)胞的抑制程度相似（P>0.0

7、5）。（2）Src影響周期的轉(zhuǎn)變。Src抑制后，C33A細(xì)胞和Hela細(xì)胞G0/G1期的比例分別升高了24.04%（t=6.101, P=0.004）和30.90%（t=-15.155, P<0.001）；S期的比例分別降低了24.46%（t=-5.842, P=0.013）和17.35%（t=13.384, P=0.001）；C33A的G2/M降低了13.20%（t=-1.317, P=0.258），Hela的G2/M降低了32.75

8、%（t=6.103, P=0.001）。僅見Hela的G2/M期對(duì)于PP2的反應(yīng)程度大于C33A（t=4.614, P=0.002）。（3）Src具有促增殖抑凋亡的作用。Src抑制后，C33A的增殖指數(shù)（PI）降低了22.64%（t=-6.101, P=0.004），Hela的PI降低了20.89%（t=14.941, P<0.001）。Src抑制前后，C33A的凋亡指數(shù)（AI）（6.90±1.50）%和（43.04±0.33）%均大于

9、Hela的（3.74±1.11）%和（14.50±1.86）%。經(jīng)比較， Src抑制前后， PI的降低值在Hela和C33A間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ t=1.613, P=0.145），而Hela細(xì)胞的AI的升高值遠(yuǎn)低于C33A細(xì)胞（t=25.834, P<0.001）。
　　3．子宮頸癌細(xì)胞中Src對(duì)ERK1/2、c-Jun、c-Fos、hnRNP E1基因表達(dá)的影響：（1）Src抑制后，Hela和C33A的ERK1、ERK2、c-Fo

10、s、c-Jun的mRNA含量較抑制前顯著升高（P<0.05），hnRNP E1 mRNA含量較抑制前顯著降低（P<0.05）。經(jīng)比較，抑制前后ERK1、c-Fos、c-Jun的mRNA在Hela中的升高值均顯著大于C33A（P<0.05）。（2）Src抑制后，Hela和C33A中的p-Src蛋白、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白、p-c-Fos蛋白和hnRNP E1蛋白含量較抑制前顯著降低（P<0.05），c-Jun蛋白和p-c-

11、Jun蛋白含量較抑制前顯著升高。經(jīng)比較，抑制前后p-Src蛋白、p-ERK1/2蛋白和c-Fos蛋白含量在C33A的降低值大于Hela，而其c-Jun和p-c-Jun蛋白含量的升高值卻低于Hela，p-c-Fos蛋白和hnRNP E1蛋白含量的降低值在C33A和Hela間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. PP2作用于Src激酶的磷酸化，即可明顯下調(diào)兩種子宮頸癌細(xì)胞的p-Src蛋白含量。Src抑制后，兩種子

12、宮頸癌細(xì)胞的Src mRNA相對(duì)含量升高，提示在基因的轉(zhuǎn)錄水平可能存在維穩(wěn)機(jī)制或其他信號(hào)因子參與調(diào)控Src基因的表達(dá)。結(jié)合Src抑制前后，Src mRNA在HPV陽性的Hela細(xì)胞中的升高值大于HPV陰性的C33A細(xì)胞，而Hela的p-Src蛋白含量的降低值小于C33A的結(jié)果，提示Src可能受HPV誘導(dǎo)而激活。
　　2. Src可促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變。Src干預(yù)后，C33A和Hela的細(xì)胞活性降低，G0/G1期所占比例升高，

13、S和G2/M比例下降，PI降低，AI上升，提示子宮頸癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變與Src激酶的活性呈正相關(guān)，Src活化可加速G0/G1向S期的轉(zhuǎn)變，為腫瘤細(xì)胞的惡性增殖提供先決條件，提示Src可作為子宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。
　　3. Src可影響ERK信號(hào)通路關(guān)鍵因子及核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)。Src抑制后，C33A細(xì)胞和Hela細(xì)胞的ERK1、ERK2、c-Jun和c-Fos基因的mRNA含量升高，hnRNP E1 mRNA含量降低，p-Src

14、蛋白、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白、p-c-Fos蛋白和hnRNP E1蛋白含量降低。提示Src參與調(diào)控ERK信號(hào)通路一系列關(guān)鍵因子以及核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)（效應(yīng)蛋白水平作用更顯著），促進(jìn)子宮頸癌變的進(jìn)展。相關(guān)信號(hào)因子的mRNA水平在Src抑制后出現(xiàn)上調(diào)可能與磷酸化的效應(yīng)蛋白含量降低后觸發(fā)了多環(huán)節(jié)的負(fù)反饋調(diào)控作用有關(guān)。Src抑制后，c-Jun基因區(qū)別于c-Fos基因的變化趨勢(shì)，出現(xiàn)了mRNA和蛋白水平的雙提升，揭示了ERK信號(hào)

15、通路的復(fù)雜性。
　　4.經(jīng)比較，Src抑制前后，HPV陰性的C33A細(xì)胞的PI降低值與HPV陽性的Hela細(xì)胞水平相當(dāng)，而 C33A的AI的升高值遠(yuǎn)大于Hela，且C33A細(xì)胞的p-Src蛋白、p-ERK1/2蛋白、c-Fos蛋白含量的降低值也顯著大于Hela細(xì)胞，進(jìn)一步提示， Src活化與HPV感染可協(xié)同調(diào)控ERK信號(hào)通路中一系列關(guān)鍵因子的表達(dá)，促進(jìn)子宮頸癌變的進(jìn)展。要想證實(shí)HPV感染確實(shí)在這一過程中發(fā)揮作用，需要在同種細(xì)胞中，