基因組編輯技術(shù)介導(dǎo)的豬GGTA1-ASGR1基因敲除研究.pdf

1、供體肝臟的嚴(yán)重短缺是限制臨床肝移植的主要瓶頸，利用豬肝臟進(jìn)行異種肝移植是有望解決臨床供肝短缺的有效途徑之一。尤其是作為“過(guò)渡肝”應(yīng)用于24h內(nèi)即會(huì)發(fā)生死亡的急性肝衰病人的治療，可以降低病人的死亡率，為后續(xù)治療爭(zhēng)取時(shí)間。豬-人異種肝臟移植面臨諸多障礙，其中超急性免疫排斥反應(yīng)和血小板減少癥是兩個(gè)首要攻克難題。豬α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因（GGTA1）催化形成的αGal表位抗原，與人體天然存在的αGal表位抗體結(jié)合會(huì)引發(fā)超急性免疫排斥反應(yīng)

2、。表達(dá)于豬肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和Kuffer細(xì)胞的去唾液酸糖蛋白受體1（ASGR1）是誘發(fā)異種肝移植后受體發(fā)生血小板減少癥的主要誘因。本研究利用基因組編輯技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)和規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)（CRISPR/Cas9）分別介導(dǎo)豬GGTA1和ASGR1基因的敲除，結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)快速高效地制備了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型豬模型，在避免超急性排斥反應(yīng)的同時(shí)減緩血小板減少癥，以期為異種肝移植的研究提供

3、更好的材料。
　　本學(xué)術(shù)論文有兩項(xiàng)研究?jī)?nèi)容，研究結(jié)果如下：
　　1、利用TALEN技術(shù)高效制備GGTA1基因敲除五指山小型豬。針對(duì)豬GGTA1基因第4外顯子設(shè)計(jì)并構(gòu)建兩對(duì)TALENs打靶載體，將TALEN mRNA電轉(zhuǎn)染豬耳成纖維細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)后采用免疫磁珠法高效富集獲得47個(gè)單細(xì)胞克隆，PCR測(cè)序鑒定均為GGTA1基因突變細(xì)胞，基因編輯效率高達(dá)100％。選擇6種不同突變類(lèi)型的GGTA1雙等位基因敲除細(xì)胞為核供體進(jìn)行體細(xì)胞

4、核移植，共移植6頭受體母豬，6頭均妊娠至終期共產(chǎn)克隆仔豬23頭，采集仔豬耳組織樣提取基因組DNA進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定，證實(shí)全部為GGTA1基因敲除仔豬。對(duì)TALEN的17個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，PCR目的片段后測(cè)序，未發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，仔豬α-Gal表位成功去除。血清裂解結(jié)果顯示，GGTA1基因敲除豬細(xì)胞能夠有效抵抗正常人血清的排斥反應(yīng)，表明有效克服了超急性免疫排斥。
　　上述結(jié)果表明，TALEN技術(shù)結(jié)合免疫磁珠

5、方法可高效敲除GGTA1基因，通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)快速獲得GGTA1雙等位基因敲除仔豬，成功克服了超急性免疫排斥。
　　2、本研究在GGTA1敲除的五指山小型豬基礎(chǔ)上，利用CRISPR/Cas9結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)制備 ASGR1基因敲除豬，為異種肝移植后血小板減少癥的研究提供良好的動(dòng)物模型。針對(duì)豬ASGR1基因設(shè)計(jì)并構(gòu)建了靶向表達(dá)載體單鏈導(dǎo)向RNA1(sgRNA1)，將sgRNA1與增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）質(zhì)粒共同電轉(zhuǎn)染GG

6、TA1基因敲除豬耳成纖維細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)富集表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞后培養(yǎng)單細(xì)胞克隆。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，共挑取細(xì)胞克隆41個(gè)，經(jīng)PCR產(chǎn)物測(cè)序，其中37個(gè)克隆發(fā)生基因突變，ASGR1基因突變效率為90%；雙等位基因敲除的細(xì)胞克隆30個(gè)，雙等位基因敲除效率為73%。選擇四個(gè)ASGR1基因敲除類(lèi)型不同的細(xì)胞為核供體進(jìn)行核移植至4頭受體豬，2頭妊娠至終期，產(chǎn)仔豬6頭，經(jīng)PCR產(chǎn)物測(cè)序，所有6頭仔豬均為ASGR1基因敲除豬；Western Blot顯示A

7、SGR1基因敲除仔豬的肝臟中沒(méi)有ASGR1的表達(dá)。對(duì)sgRNA1的13個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，未檢測(cè)到脫靶現(xiàn)象。總之，本研究利用 CRISPR/Cas9快速高效地制備了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型豬模型，有望解決異種肝移植后出現(xiàn)的血小板減少癥。
　　綜上所述，本研究利用基因組編輯技術(shù)在豬體細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了精確的基因編輯，結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)快速高效地制備了GGTA1/ASGR1基因敲除五指山小型豬模