基因組編輯技術(shù)ppt課件

1、基因組編輯,應(yīng)用基因編輯技術(shù)不長(zhǎng)角的奶牛,基因編輯的定義： 通過(guò)精確識(shí)別靶細(xì)胞DNA片段中靶點(diǎn)的核苷酸序列，利用核酸內(nèi)切酶對(duì)DNA靶點(diǎn)序列進(jìn)行切割，從而完成對(duì)靶細(xì)胞DNA目的基因片段的精確編輯。,基因編輯的優(yōu)勢(shì),與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)保留了可定點(diǎn)修飾的特點(diǎn)，可應(yīng)用到更多的物種上，效率更高，構(gòu)建時(shí)間更短，成本更低。,基因編輯原理,

2、現(xiàn)代基因組編輯技術(shù)的基本原理是相同的，即借助特異性 DNA 雙鏈斷裂( DNA double-strand breaks DSBs) 激活細(xì)胞天然的修復(fù)機(jī)制，包括非同源末端連接( NHEJ)和同源重組修復(fù)(HDR) 兩條途徑。,第一代: ZFN(鋅指核酸酶) 第二代: TALEN(轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶)第三代: CRISPR/Cas9(成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列)第四代：NgAgo - gDNA 韓春雨,基因編輯

3、發(fā)展史,ZFN 基因組編輯技術(shù),ZFN 技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，其功能的實(shí)現(xiàn)是基于具有獨(dú)特的DNA序列識(shí)別的鋅指蛋白發(fā)展起來(lái)的。 1986年Diakun 等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子家族的 DNA 結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2- His2鋅指模塊。 1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。 2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對(duì)由4個(gè)鋅指連接而成的ZFN可識(shí)別24 bp的特異性序列，由此揭開(kāi)了ZFN在

4、基因組編輯中的應(yīng)用。,ZFN 誘導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基 因位點(diǎn)，具有較好的發(fā)展?jié)摿Α?缺點(diǎn): (1)以現(xiàn)有的策略設(shè)計(jì)高親和性的 ZFN，需要投入大量的工作和時(shí)間;(2)在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá) ZFN 對(duì)細(xì)胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設(shè)計(jì)具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應(yīng)。,TALEN 基因組編輯技術(shù),2009 年，研究者在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子(TAL蛋

5、白),它的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系,一個(gè)模塊單元識(shí)別一個(gè)堿基，簡(jiǎn)單且特異性極好。隨后，TALE特異識(shí)別 DNA 序列的特性被用來(lái)取代 ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它可設(shè)計(jì)性更強(qiáng)，不受上下游序列影響，具備比ZFN 更廣闊的應(yīng)用潛力。,TALENs 包含兩個(gè) TALEN 蛋白, 每個(gè) TALEN 都是由 TALE array 與 FokⅠ融合而成. 其中一個(gè) TALEN 靶向正義鏈上靶標(biāo)位點(diǎn), 另一個(gè)則靶向反義

6、鏈上的靶標(biāo)位點(diǎn). 然后 FokⅠ形成二聚體, 在靶向序列中間的 spacer 處切割 DNA, 造成雙鏈 DNA 斷裂, 隨后細(xì)胞啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制. 針對(duì)不同的TALEN 骨架, 其最適宜的spacer長(zhǎng)度不同, 其長(zhǎng)度范圍一般為12~20 bp.,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, TALENs在靶向DNA時(shí), 第一個(gè)堿基為 T 時(shí)其結(jié)合效果更佳。通過(guò)組合各類(lèi)模塊，可對(duì)任意核苷酸序列進(jìn)行靶向特異性敲除或內(nèi)源基因的表達(dá)調(diào)控。 目前

7、已在人、大鼠、小鼠、豬、羊、斑馬魚(yú)、擬南芥及酵母等多類(lèi)物種中得到成功應(yīng)用。,CRISPR /Cas9 基因組編輯技術(shù) CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1987年，日本學(xué)者首次在大腸桿菌(E. coli)基因組中發(fā)現(xiàn)一連串短的空間間隔重復(fù)序列。隨后，在其他細(xì)菌和古細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了這一特殊的序列。 2002年科學(xué)家才將其命名為成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly int

8、erspaced short palindromic repeats, CRISPR) ，現(xiàn)有測(cè)序結(jié)果顯示40%的細(xì)菌基因組中含有CRISPR位點(diǎn)。 2005年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)CRISPR中的許多間隔序列來(lái)源于質(zhì)粒和病毒，CRISPR的基因座能夠被轉(zhuǎn)錄，并且Cas基因編碼的蛋白具有核酸酶和解旋酶結(jié)構(gòu)域，因此推測(cè)CRISPR/ Cas 是利用無(wú)義的RNAs標(biāo)記外源核酸序列的防御系統(tǒng)。,,2011年，才揭示了CRISPR/Cas系統(tǒng)

9、的分子機(jī)制：當(dāng)病毒首次入侵時(shí)，細(xì)菌會(huì)將外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的間隔區(qū)；病毒二次入侵時(shí)，CRISPR轉(zhuǎn)錄生成crRNA前體(pre-crRNA)，pre-crRNA經(jīng)過(guò)加工形成含有與外源基因匹配序列的 crRNA，該crRNA與病毒基因組的同源序列識(shí)別后，介導(dǎo)Cas蛋白結(jié)合并切割，從而保護(hù)自身免受入侵。 2013年，研究者報(bào)道了CRISPR/Cas9系統(tǒng)可高效地編輯基因組。其中分別在人類(lèi)細(xì)胞和小鼠

10、細(xì)胞中成功對(duì)部分基因?qū)崿F(xiàn)了編輯。,CRISPR/Cas系統(tǒng)概述 CRISPR/ Cas系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌和古菌中，是它們的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能夠識(shí)別自身和外源入侵DNA片段。CRISPR/ Cas系統(tǒng)有3種類(lèi)型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。 Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)較為復(fù)雜，需要多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合體切割DNA雙鏈，而Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)只需要一個(gè)Cas9蛋白核酸酶來(lái)切割DNA雙鏈,即為

11、現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)基因編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。 TypeⅡ系統(tǒng)中只有一種核酸酶—Cas9核酸酶，在該系統(tǒng)中Cas9蛋白與crRNA參與對(duì)抗外源噬菌體和質(zhì)粒的入侵。目前，TypeⅡ系統(tǒng)在基因組編輯中應(yīng)用的最為廣泛。,CRISPR-Cas主要由兩部分組成：,CRISPR/Cas的結(jié)構(gòu)CRISPR 是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族, 廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR 位點(diǎn)通常由短的高度保守的重復(fù)序列(

12、repeats) 組成, 重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常 21~48 bp, 重復(fù)序列之間被 26~72 bp 間隔序列(spacer)隔開(kāi)。CRISPR就是通過(guò)這些間隔序列（space）與靶基因進(jìn)行識(shí)別。,Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guide RNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類(lèi)似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。,CRISPR/

13、Cas9系統(tǒng)由間隔重復(fù)CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄出來(lái)的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA組成，其中tracrRNA促進(jìn)pre-crRNA的成熟，以及形成具有切割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元復(fù)合體。 病毒或質(zhì)粒入侵細(xì)菌后，其基因組DNA暴露于細(xì)菌胞漿之中，經(jīng)過(guò)同源重組，CRISPR重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄、翻譯出的Cas復(fù)合物對(duì)外來(lái)DNA進(jìn)行剪切，產(chǎn)生新的spacer序列。如果產(chǎn)生的新s

14、pacer序列能夠與CRISPR array內(nèi)部的短重復(fù)序列部分互補(bǔ)，將會(huì)通過(guò)某種未知的方式整合到細(xì)菌基因組的CRISPR array 序列中，從而對(duì)該病毒或質(zhì)粒產(chǎn)生特異性免疫記憶。,CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理和機(jī)制,CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作原理和機(jī)制,當(dāng)同類(lèi)的病毒或者質(zhì)粒再次入侵該細(xì)菌時(shí) 首先，tracrRNA與pre-crRNA的重復(fù)序列結(jié)合； 第二，內(nèi)源RNase Ⅲ切割p

15、re-crRNA/ tracrRNAs復(fù)合體，切除5′末端的間隔序列，形成成熟的crRNA，并與tracrRNA形成被稱(chēng)為向?qū)NA (Single guide RNA, sgRNA)的嵌合RNA分子； 第三，每一個(gè)成熟的sgRNA能夠引導(dǎo)Cas9蛋白定位到雙鏈DNA的靶位點(diǎn)上并在原型間隔毗鄰序列(Proto-spacer adjacent motif, PAM)的上游3~8 bp位置對(duì)結(jié)合的序列進(jìn)行切割(圖2A)。,Cas9的特

16、異性靶點(diǎn) 依賴(lài)于原型間隔序列3′端PAM序列，不同的Cas9突變體在基因組中擁有不同的PAM序列，來(lái)源于釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9識(shí)別一個(gè)5′- NGG-3′的PAM，而來(lái)源于嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningi-tidis)的Cas9分別識(shí)別5′-NNAGAAW-3′的PAM和5′-NNNNGATT

17、-3′的PAM。 Cas9擁有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域 分別是蛋白中間的HNH結(jié)構(gòu)域和蛋白氨基酸末端附近的RuvC-like結(jié)構(gòu)域，其中HNH切割與crRNA互補(bǔ)的鏈，切割位點(diǎn)位于PAM序列上游3 bp，RuvC-like切割非互補(bǔ)鏈，切割位點(diǎn)位于PAM序列上游3~8 bp，從而造成雙鏈的斷裂。,Cas9的特異性靶點(diǎn)和兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域,CRISPR/ Cas9產(chǎn)生的DSB能夠激活細(xì)胞和生物體自身修復(fù)機(jī)制，產(chǎn)生兩種不同

18、的修復(fù)途徑NHEJ和HDR修復(fù)。NHEJ能夠高效地引入不同長(zhǎng)度的插入或者缺失突變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄閱讀框編碼序列，轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的損壞；而HDR的修復(fù)通常會(huì)引入特定位點(diǎn)的突變或者在外源供體DNA模板存在時(shí)對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行可預(yù)測(cè)的插入。,1. PAM序列區(qū)是CRISPR/Cas9系統(tǒng)行使切割功能的基本條件。如果靶序列3′端沒(méi)有PAM序列，即使靶序列與sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不會(huì)切割該序列位點(diǎn).,2. sgRNA與目標(biāo)基因組

19、相結(jié)合的20nt序列區(qū)決定著CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向特異性。,CRISPR/Cas9系統(tǒng)的關(guān)鍵點(diǎn),3. sgRNA的長(zhǎng)度也與特異性密切相關(guān)。sgRNA的5′端額外增加兩個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸后能夠顯著提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性。,CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的特異性決定于sgRNA上的識(shí)別(~20nt)。然而，在復(fù)雜的生物基因組中，sgRNA的識(shí)別序列可能會(huì)與非靶點(diǎn)DNA發(fā)生局部匹配(Partial match)。

20、 這種局部匹配，目前可歸結(jié)為兩類(lèi)：sgRNA與脫靶位點(diǎn)DNA序列長(zhǎng)度相同，但存在堿基錯(cuò)配。(2) 脫靶位點(diǎn)DNA序列長(zhǎng)度比sgRNA多或少幾個(gè)堿基，通過(guò)形成DNA凸起(DNA bulge)或RNA凸起(RNA bulge)來(lái)完成其他堿基的正確配對(duì)。,CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng),CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組DNA片段編輯中的應(yīng)用,1. DNA片段靶向刪除2. DNA片段靶向反轉(zhuǎn)3. DNA片段靶向重復(fù)

21、4. DNA片段靶向插入5. 染色體靶向易位,編輯技術(shù)對(duì)比,NgAgo-gDNA編輯,NgAgo-gDNA是格式嗜鹽桿菌（Natronobactricum grogoryi) ACO蛋白（Argonauto）的簡(jiǎn)稱(chēng)，其本質(zhì)是一種核酸內(nèi)切酶，NgAgo根據(jù)指導(dǎo)DNA的定位，可以有效地對(duì)基因組目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行編輯。,NgAgo-gDNA 概述,,NgAgo,是格氏嗜鹽堿,桿,菌,（,Natronobacterium,gregoryi,）,A

22、GO,蛋,白,（,Argonaute,）,的,簡(jiǎn),稱(chēng),，,其,本,質(zhì),是,一,種,核,酸,內(nèi),切,酶,。,NgAgo,酶根據(jù)指導(dǎo),DNA,的定位,，,可以有效地對(duì)基因,組目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行編輯,。,NgAgo-gDNA 與 Crispr-Cas9 特點(diǎn)比較,NgAgo-gDNA 的優(yōu)勢(shì),1. 設(shè)計(jì)更加靈活 由于NgAgo-gDNA系統(tǒng)無(wú)PAM要求，5'p ssDNA設(shè)計(jì)相較sgRNA更加靈活2. 理論上精確性會(huì)比

23、Crispr-CAS9 高 NgAgo-gDNA識(shí)別靶序列的長(zhǎng)度會(huì)比Crispr-Cas9長(zhǎng)約4個(gè)堿基，另外DNA-DNA duplex的特異性比RNA-DNA duplex高,所以理論上精確性會(huì)更加高。3. 對(duì)向?qū)蛄?靶序列錯(cuò)配容忍度低 脫靶率低5. 針對(duì)富含GC的靶序列，NgAgo系統(tǒng)比Cas9系統(tǒng)切割效率更高,基因功能研究基因治療構(gòu)建模式動(dòng)物改造和培育新品種,基因編輯新技術(shù)的用途,1. 基因功能研究,

24、基因敲除是在活體動(dòng)物上驗(yàn)證基因功能必不可少的邏輯環(huán)節(jié)， 但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過(guò)復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、 ES 細(xì)胞篩選、 嵌合體動(dòng)物模型選育等一系列步驟， 成功率受到多方面因素的限制。,基因編輯新技術(shù)則不然， 敲除基因高效快速， 是研究基因功能的有力工具,ZFN 技術(shù)已在大鼠、小鼠、斑馬魚(yú)、果蠅、擬南芥、玉米、煙草 等模式生物或經(jīng)濟(jì)物種的細(xì)胞或胚胎中以及包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells

25、，iPSC)在內(nèi)的人體外培養(yǎng)細(xì)胞系中成功地實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變，其中在果蠅、 斑馬魚(yú)、大鼠等物種中還獲得了可以穩(wěn)定遺傳的突變體。,2. 基因治療,傳統(tǒng)的基因治療是將正常的基因片段引入細(xì)胞中替代有缺陷的基因， 但這種方法難以精準(zhǔn)控制， 可能產(chǎn)生很大的毒副作用?；蚓庉嬓录夹g(shù)可以精確定位， 在靶位點(diǎn)進(jìn)行修正或進(jìn)行基因切除， 達(dá)到基因治療的目的。,Bacman 等人利用 TALEN 技術(shù)清除了來(lái)自于病人線粒體內(nèi)的有病 DNA。這是 TAL

26、EN 首次應(yīng)用于線粒體基因的編輯，這項(xiàng)研究有望用于治療母系遺傳的線粒體病。,Li 等人利用 ZFN 技術(shù)能在染色體上精確定位的優(yōu)勢(shì)， 通過(guò) “剪切” 和 “粘貼” 基因， 在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了血友病治療， 避免了傳統(tǒng)基因療法帶來(lái)的插入誘變風(fēng)險(xiǎn)， 首次取得了基因組編輯在基因療法上的突破。,3. 構(gòu)建模式動(dòng)物,基因編輯新技術(shù)不受 ES 細(xì)胞的限制，效率高，速度快，且定點(diǎn)編輯更加精確，可在多種細(xì)胞及生物體的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割和修飾。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小

27、鼠第一人 Jaenisch 與其同事最近利用 CRISPR- Cas 系統(tǒng)又構(gòu)建了攜帶特異性突變的小鼠模型。,4. 改造和培育新品種,傳統(tǒng)的改造動(dòng)植物品種的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源 DNA 片段插入受體的基因組中，改造基因功能，使其表達(dá)優(yōu)良的性狀，獲得人類(lèi)需要的品種?；蚓庉嫾夹g(shù)則可以進(jìn)行定點(diǎn)修飾， 達(dá)到高效定向。,Shukla 等對(duì)玉米進(jìn)行肌醇磷酸激酶 1(inositol phosphate kinase 1，IPK1)基因的修飾，使其對(duì)

28、除草劑的耐性增強(qiáng)，在發(fā)育的種子中肌醇磷酸鹽表達(dá)譜也發(fā)生了與預(yù)期一樣的改變。 ownsend等以煙草中的丙酮醇合酶(acetolactate synthase)基因 SuR (SuRA和SuRB)位點(diǎn)為靶標(biāo)，育成了對(duì)咪唑啉酮(imidazolinone)除草劑和對(duì)磺脲(sulphonylurea)除草劑都有抵抗力的新品種。,基因編輯技術(shù)的展望,隨著越來(lái)越多物種基因組測(cè)序的完成，基因功能的研究成為后基因時(shí)代的重點(diǎn)?；?/p>