通過鋅指核酸酶和體細(xì)胞核移植技術(shù)產(chǎn)生Myostatin和GGTA1基因敲除的轉(zhuǎn)基因克隆豬.pdf

1、轉(zhuǎn)基因修飾豬可以用于改良物種，促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展，也可以作為器官移植中的低免疫原性供體，因此在醫(yī)藥學(xué)及畜牧業(yè)等領(lǐng)域擁有巨大的應(yīng)用潛力。傳統(tǒng)的基因打靶效率非常低。新興技術(shù)鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)能夠有效的介導(dǎo)基因的定點(diǎn)修飾，效率高達(dá)1％，這有望從根本上解決體細(xì)胞基因組定點(diǎn)修飾效率低的問題。
　　本研究主要是通過鋅指核酸酶技術(shù)高效建立了肌肉抑制素基因（Myostatin）和α-1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(

2、α-1，3-galactosyl-transferase，GGTA1)基因雙等位基因敲除細(xì)胞系，比傳統(tǒng)的基因打靶效率提高了10000倍。同時(shí)，結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)產(chǎn)生了Myostatin和GGTA1雙等位基因敲除的轉(zhuǎn)基因克隆豬，為建立瘦肉型豬的新品系，以及為豬-人的異種器官移植打下理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.產(chǎn)生Myostatin基因敲除的克隆豬。將特異性識(shí)別Myostatin的鋅指核酸酶轉(zhuǎn)入大白豬的成纖維細(xì)胞LW5中，藥殺

3、篩選后，得到10個(gè)單敲細(xì)胞系，2個(gè)雙敲細(xì)胞系，在細(xì)胞水平的打靶效率分別為11.6％，2.3％.以兩個(gè)雙等位基因敲除的細(xì)胞系M11，M100為核供體進(jìn)行核移植，產(chǎn)生8頭轉(zhuǎn)基因克隆豬。
　　2.產(chǎn)生GGTA1基因敲除的克隆豬。將特異性識(shí)別GGTA1的鋅指核酸酶轉(zhuǎn)入大白豬的成纖維細(xì)胞系LW5中，加藥篩選后，產(chǎn)生了18個(gè)單敲細(xì)胞系，4個(gè)雙敲的細(xì)胞系，細(xì)胞水平的打靶效率分別為23.4％，5.2％.以雙等位基因敲除的細(xì)胞系G3，G56，G65