豬體細(xì)胞核移植相關(guān)影響因素的研究.pdf

1、為進(jìn)一步提高豬體細(xì)胞核移植的效率，完善豬體細(xì)胞核移植的技術(shù)程序，本研究從供體細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控、受體卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)、重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)和體細(xì)胞的重編程等方面對豬體細(xì)胞核移植的相關(guān)影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究，取得了如下研究結(jié)果。
　　 1.采用流式細(xì)胞儀檢測法對豬成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控方法進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞血清饑餓培養(yǎng)(0.5％ FBS)24-72小時，顯著提高G0/G1期的細(xì)胞百分率（92.2～93.7％ vs.77

2、.8％，P＜0.05）;細(xì)胞培養(yǎng)至完全匯合后24-48小時，G0/G1期的細(xì)胞比例(94.4％，89.6％)類似于血清饑餓法;血清饑餓培養(yǎng)24小時后，再用10％FBS培養(yǎng)24h，細(xì)胞的G0/G1期比例有回復(fù)到饑餓培養(yǎng)前的水平(79.4％)。用完全匯合培養(yǎng)法和血清饑餓法培養(yǎng)處理后的體細(xì)胞進(jìn)行核移植，均能獲得類似的分裂率(76.2％ VS.84.5％，P＞0.05)與囊胚率(14.3％ vs.12.4％，P＞0.05)。結(jié)果表明，豬成纖維細(xì)

3、胞通過血清饑餓法或完全匯合培養(yǎng)法均能有效的將細(xì)胞周期同期化至G0/G1期。
　　 2.研究了在體外成熟過程中添加激活素A對卵子核成熟悉和胞質(zhì)成熟的影響。豬卵母細(xì)胞在TCM-199培養(yǎng)液培養(yǎng)40 h，期間添加不同劑量的ActivinA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加10 ng/ml或100 ng/ml時，第一極體排出率相對空白對照組顯著提高(60.5％，66.1％vs.50.5％，P＜0.05)，但孤雌激活胚胎培養(yǎng)的囊胚發(fā)育率沒有顯著差異(P＞

4、0.05)。通過紅色熒光探針染色后經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察作為胞質(zhì)成熟標(biāo)志的線粒體排布形態(tài)類型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)激活素A處理后，相對于空白對照組，處于彌散型分布形態(tài)的卵子數(shù)目極顯著增加(87.9％vs.66.4％，P＜0.01)，同時圓周型排布(1.8％ vs.18.1％，P＜0.01)與半周型排布的線粒體排布形態(tài)的卵子數(shù)目顯著下降(8.4％ vs.13.8％，P＜0.05)。結(jié)果表明，豬卵母細(xì)胞在體外成熟期間添加激活素A，能促進(jìn)卵母細(xì)胞的核成熟與

5、胞質(zhì)成熟。
　　 3.目前豬胚胎的體外培養(yǎng)大多采用NCSU-23，但其培養(yǎng)效果尚不理想，本研究比較了PZM-3與NCSU-23兩種培養(yǎng)液的豬胚胎體外培養(yǎng)效果，以找出一種更適合豬胚胎體外培養(yǎng)的培養(yǎng)液。孤雌激活的胚胎或核移植重構(gòu)胚分別用PZM-3與NCSU-23培養(yǎng)后，觀察胚胎發(fā)育情況，并通過實時熒光定量PCR檢測不同培養(yǎng)液培養(yǎng)所得核移植囊胚的調(diào)亡相關(guān)基因BCL-2，印跡相關(guān)基因IGF2R（胰島素生長因子受體Ⅱ），和代謝相關(guān)基因PG

6、K1（磷酸甘油酸酯酶I）的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孤雌激活胚胎或者核移植重構(gòu)胚培養(yǎng)于PZM-3和NCSU-23培養(yǎng)液時，其分裂率(82.3％ vs.85.2％,P＞0.05)和囊胚發(fā)育率(26.5％ vs.20.0％, P＞0.05)沒有顯著差異;但在PZM-3培養(yǎng)下的孤雌激活胚胎的囊胚細(xì)胞總數(shù)顯著高于NCSU-23培養(yǎng)下的囊胚細(xì)胞總數(shù)(55.2±6.34 vs.36.6±2.82，P＜0.05)，而核移植囊胚細(xì)胞總數(shù)在這兩種培養(yǎng)基下沒有顯

7、著差異（51.6±2.7 vs.48.2±3.0，P＞0.05）。在這兩種培養(yǎng)液所得重構(gòu)胚囊胚相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平上，PZM-3培養(yǎng)液的囊胚1GF2R mRNA相對表達(dá)豐度顯著高于NCSU-23(P＜0.05);而BCL-2與PGK1的表達(dá)豐度差異不顯著(P＞0.05)。由此可見，不同的豬胚胎培養(yǎng)體系能影響胚胎早期發(fā)育能力與相關(guān)基因表達(dá)水平，PZM-3培養(yǎng)液的豬胚胎培養(yǎng)效果優(yōu)于NCSU-23。
　　 4.研究了去乙?；敢种苿㏒cr

8、iptaid對體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚組蛋白乙?；?、基因表達(dá)水平和胚胎發(fā)育能力的影響。結(jié)果顯示，用500 nM的Scriptaid處理重構(gòu)胚12小時，能顯著提高囊胚發(fā)育率(21.0％ vs.9.7％，P＜0.05)。此外，相對于未處理的核移植胚胎(NT組)，Seriptaid處理核移植胚胎后能整體提高H3組蛋白18位氨基的乙?；剑⑶以撘阴；脚c體外受精胚胎（IVF組）乙酰化水平相當(dāng)。通過檢測核移植囊胚相關(guān)基因（包括多能性基因OCT

9、4和REX01，組蛋白乙酰化相關(guān)基因HDAC2和HAT1，代謝相關(guān)基因PGK1）的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，NT囊胚的OCT4與PGK1以及NT-S囊胚的REX01、HDAC2、HAT1和PGK1表達(dá)水平與IVF囊胚的表達(dá)水平相當(dāng)，但NT囊胚的REX01與HAT1表達(dá)水平顯著低于IVF和NT-S囊胚的表達(dá)水平，而HDAC2的表達(dá)水平則顯著高于IVF和NT-S囊胚的表達(dá)水平。
　　 上述結(jié)果表明，用Scriptaid處理能提高SCNT重構(gòu)胚胎