豬體細(xì)胞核移植及體外受精技術(shù)的研究.pdf

1、本研究對豬卵母細(xì)胞體外成熟、孤雌激活、體外受精、供核細(xì)胞培養(yǎng)、體細(xì)胞核移植及胚胎培養(yǎng)等技術(shù)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并對相關(guān)影響因素做了對比和分析，以此建立豬體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)實(shí)驗(yàn)體系，為進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因豬的研究提供理論和技術(shù)支持。
　　 本研究包括以下主要內(nèi)容：（1）在IVM培養(yǎng)液中添加不同的激素或激素組合、添加不同濃度比例的FSH、LH、必須和/或非必需氨基酸等，研究它們對豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響。（2）在不同成熟培養(yǎng)體系中

2、，成熟的卵母細(xì)胞經(jīng)孤雌激活后的胚胎發(fā)育情況；不同的激活電壓和電脈沖時(shí)長組合對豬卵母細(xì)胞孤雌激活效率和胚胎發(fā)育能力的影響；CHX對豬卵母細(xì)胞孤雌激活效率和胚胎發(fā)育能力的影響。（3）不同體外受精液、受精時(shí)間、精子上浮時(shí)間、精液供體、顆粒細(xì)胞存在與否等條件對卵母細(xì)胞體外受精效果和胚胎發(fā)育的能力的影響。（4）初生仔豬耳/尾成纖維細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特征研究。（5）不同組織來源的供核細(xì)胞、不同激活劑或氨基酸培養(yǎng)條件對豬體細(xì)胞核移植胚胎的發(fā)育能力

3、的影響。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 實(shí)驗(yàn)一、豬卵母細(xì)胞體外成熟條件的研究
　　 （1）不同激素或激素組合對豬卵母細(xì)胞體外成熟影響很大，研究中發(fā)現(xiàn)，在含激素成熟液中培養(yǎng)22h后，無激素培養(yǎng)至44h條件下，添加PMSG+hCG組的卵母細(xì)胞核成熟率85.9±2.1％，高于FSH+LH組和E2組；不添加任何激素的對照組最低只有33.8±2.2％。
　　 （2）在豬卵母細(xì)胞IVM過程中，F(xiàn)SH對豬卵母細(xì)胞體外

4、核成熟率的影響較大并與其濃度有關(guān)，隨著FSH濃度上升，豬卵母細(xì)胞成熟率隨之上升；LH在低濃度時(shí)對豬卵母細(xì)胞體外成熟率的影響不大，當(dāng)濃度達(dá)到或超過10 IU時(shí)對成熟產(chǎn)生促進(jìn)作用；兩種激素具有相互協(xié)同的作用，當(dāng)在成熟液中添加10 IU/mL的FSH和20 IU IU/mL的LH時(shí)，豬卵母細(xì)胞成熟率達(dá)到最大80.9±2.2％。
　　 （3）在豬卵母細(xì)胞IVM液中無論是添加必需氨基酸或非必需氨基酸，或同時(shí)添加它們，都能夠提高豬卵母細(xì)胞體

5、外核成熟比例。其中添加非必需氨基酸的促進(jìn)作用最大，核成熟比例最高達(dá)到83.0±2.8％；添加了必需氨基酸的成熟比例為78.6±1.5％；同時(shí)添加兩種氨基酸為79.9±1.1％，略低于非必需氨基酸組。不添加氨基酸組的對照組成熟率只有74.9±2.4％。
　　 實(shí)驗(yàn)二、豬體外成熟卵母細(xì)胞孤雌激活條件研究
　　 （1）在不同激素條件的成熟液中成熟的卵母細(xì)胞，在經(jīng)孤雌激活和胚胎培養(yǎng)后孤雌胚胎的發(fā)育能力明顯不同。無激素對照組最低，

6、卵裂率24.4±4.3％，未獲得囊胚；添加PMSG+hCG的成熟液中成熟的卵母細(xì)胞激活后，卵裂率和囊胚率最高，分別為85.2±2.4％和55.3±1.3％；
　　 （2）豬卵母細(xì)胞孤雌激活的效果與電場強(qiáng)度和脈沖時(shí)長之間存在直接的關(guān)系。其中，受電場強(qiáng)度影響最大，在較低電壓范圍內(nèi)，增加電場強(qiáng)度會提高激活效率，在較高電場強(qiáng)度范圍內(nèi)則相反。本研究中電激活的最佳條件為2.0kV/cm、30 ms、1DC，卵裂率達(dá)到90.34±1.4％、囊

7、胚率達(dá)到46.7±1.9％。
　　 （3）CHX的應(yīng)用能夠提高體外成熟豬卵母細(xì)胞孤雌激活效率，這種促進(jìn)與CHX作用時(shí)間和作用方式有關(guān)。電激活后，在CHX中處理8h效果最好，卵裂率87.1±1.6％和囊胚率42.9±1.1％。另外，CHX預(yù)處理也會提高激活效率，其中CHX預(yù)處理15min效果最好。
　　 實(shí)驗(yàn)三、影響豬卵母細(xì)胞體外受精的因素研究
　　 （1）豬卵母細(xì)胞體外受精效率受多種因素影響，本研究中發(fā)現(xiàn)，將精子

8、上浮處理60min，含2-3層顆粒細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體在mTBM受精液中與精子共孵育6h條件下的受精效果最好，卵裂率為77.6±2.3％，囊胚率25.7±2.6％。
　　 （2）體外受精效率受提供精液的公豬個(gè)體影響很大，不同個(gè)體精液的IVF能力差異極顯著。
　　 實(shí)驗(yàn)四、影響體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育能力的因素
　　 （1）仔豬耳或尾成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的生物學(xué)特征無顯著差異。
　　 （2）不同的激活劑

9、對重構(gòu)胚的激活和胚胎進(jìn)一步的發(fā)育能力的影響很大，其中CHX的激活和促進(jìn)胚胎發(fā)育的能力最強(qiáng)，卵裂率67.4±0.6％，囊胚率為19.6±2.1％，6-DMAP次之，CB最差，各組間差異顯著。
　　 （3）不同組織來源的供核細(xì)胞對重構(gòu)胚的發(fā)育能力的影響很大，其中初生仔豬耳成纖維細(xì)胞作為核供體時(shí)的重構(gòu)胚發(fā)育率最高，卵裂率為65.6±3.3％，囊胚率為17.8±2.2％初生仔豬尾成纖維細(xì)胞最差，卵丘顆粒細(xì)胞供體發(fā)育率居中。