綿羊和山羊轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植技術(shù)的研究.pdf

1、該文旨在為通過(guò)體細(xì)胞克隆途徑生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊和山羊建立一套實(shí)用的核移植技術(shù)程序.為此采用成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞對(duì)體細(xì)胞核移植各個(gè)關(guān)鍵步驟包括:卵母細(xì)胞成熟、去核、融合和激活的條件進(jìn)行摸索.此外,對(duì)供體細(xì)胞周期同步化的方法和利用同源重組打靶栽體生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊的技術(shù)進(jìn)行了初步探索.選擇綿羊和山羊的成年和胎兒成纖維細(xì)胞建系并進(jìn)行Sry PCR性別鑒定.培養(yǎng)后期添加早期培養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)液,有利于保持體外培養(yǎng)至20代的細(xì)胞染色體數(shù)正確,不發(fā)生顯著變

2、化,因此20代內(nèi)細(xì)胞可以用于基因轉(zhuǎn)染、篩選以及核移植.綿羊卵母細(xì)胞成熟時(shí)間和去核時(shí)間以24小時(shí)為宜;成纖維細(xì)胞與卵母細(xì)胞適宜電融合條件為:5V交流電預(yù)處理,脈沖場(chǎng)強(qiáng)2.0v/cm,脈沖時(shí)程20-30μsec,脈沖次數(shù)兩次;重構(gòu)胚采用離子霉素激活的卵裂率顯著高于乙醇和A23187處理組.山羊卵母細(xì)胞成熟率在成熟培養(yǎng)20-28小時(shí)內(nèi)變化不顯著;去核時(shí)間24-26小時(shí)為宜;成纖維細(xì)胞與卵母細(xì)胞的融合場(chǎng)強(qiáng)范圍適宜在2.0-2.6kv/cm;離子

3、霉素+1.9mM6-DMAP處理組原核形成率顯著高于離子霉素+10μg/ml CHX處理組以及添加2μg/ml CD的CHX激活組.山羊卵母細(xì)胞成熟28小時(shí)激活,胚胎的桑椹胚和囊胚形成率最高.該文還對(duì)體細(xì)胞克隆生產(chǎn)定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因胚胎進(jìn)行了初步研究.實(shí)驗(yàn)中采用pLoxp正負(fù)篩選載體構(gòu)建的mAAT同源重組載體(mAAT)和Myostatin同源敲除型載體(Myo),以及基于pEGFP載體構(gòu)建的GFP同源重組型載體,轉(zhuǎn)染山羊和綿羊的成年和胎兒

4、成纖維細(xì)胞,經(jīng)G418和GANC篩選的陽(yáng)性細(xì)胞作為供體進(jìn)行核移植.隨機(jī)型GFP和同源型GFP供體細(xì)胞其融合率、卵裂率和發(fā)育至桑椹和囊胚的百分率在不同細(xì)胞系有顯著差異;GFP、Myo和mAAT體細(xì)胞重構(gòu)胚的融合率和卵裂率無(wú)顯著差異(P>0.05);綿羊mAAT組桑囊率顯著低于GFP和Myo組;山羊GFP與Myo細(xì)胞之間的核移植效率差異不顯著.早期克隆胚胎能夠表達(dá)外源基因,說(shuō)明在體細(xì)胞中整合同源重組型表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)基因在胚胎中定點(diǎn)整合是可行的