利用鋅指核酸酶敲除斑馬魚目的基因的實驗體系的初步構建.pdf

1、斑馬魚因其個體小、易于飼養(yǎng)、性成熟周期短、體外受精和發(fā)育、易繁殖且繁殖率高、胚體透明容易觀察、便于胚胎操作等優(yōu)勢,現(xiàn)已廣泛地應用于基因功能相關研究。近年來在基因功能研究和疾病的基因治療方面,基因組定點突變逐漸成為反向遺傳學的研究熱點,具有廣闊的應用前景。在小鼠中通過同源重組進行基因敲除研究基因功能的技術已經(jīng)相當成熟了,但是在其它低等脊椎動物和無脊椎動物中,還沒有成熟的基因敲除技術。目前可以應用于斑馬魚的反向遺傳學技術很有限,主要有TIL

2、LING技術、RNAi技術和Morpholinos技術。但是這些技術都不能獲得斑馬魚目的基因敲除突變體,因而限制了斑馬魚反向遺傳學的研究。
　　 鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)包括兩個部分,即鋅指蛋白(zinc fingerprotein,ZFP)結構域和FokⅠ結構域,其中ZFP負責與特異性的核酸序列結合,而切割結構域FokⅠ對DNA進行切割,形成DNA序列雙鏈斷裂。ZFN可使生物體通過非同源末

3、端連接在斷裂處產(chǎn)生突變,有望成為斑馬魚等生物基因敲除的得力工具。
　　 本課題主要以斑馬魚為模式生物,以小眼相關轉錄因子小眼相關轉錄因子a(microphthalmia-associate transcription factor a,mitfa)基因為靶位點,構建操作簡便切實可行的目的基因敲除實驗體系。首先,選擇斑馬魚mitfa基因DNA序列的第2965bp～2988bp為靶位點,并設計一對特異性識別靶位點DNA序列的鋅指蛋白

4、。第二步,利用DNAWorks針對每一個ZFP設計出14條序列,通過兩步法PCR合成ZFPs的編碼序列276bp。第三步,將ZFPs的編碼序列與切割結構域FokⅠ連接到表達載體PET-30a構成帶組氨酸標簽的ZFNs。第四步,利用Escherichia coli在22℃,0.3mM IPTG誘導下表達可溶性ZFNs,通過組氨酸親和柱純化ZFNs并利用SDS-PAGE進行檢測。第五步,在25℃下,體外檢測到ZFNs具有切割靶位點DNA的能

5、力。最后,將ZFNs導入斑馬魚體內(nèi),獲得了一條攜帶mitfa突變基因的斑馬魚,突變發(fā)生在斑馬魚mitfa基因第2977bp～2979bp。
　　 在整個實驗體系中,我們首次引入DNAWorks和兩步法PCR,極大地簡化了ZFPs的DNA序列合成步驟;在體外表達ZFNs時,通過培養(yǎng)基優(yōu)化獲得了更多的可溶性ZFNs,簡化了ZFNs的純化過程;在斑馬魚體內(nèi)進行目的基因敲除過程中,采用CMV啟動子,增強了ZFNs表達的廣泛性。通過系統(tǒng)研