Staphylococcus aureus感染斑馬魚(yú)淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及其死亡受體基因家族的初步研究.pdf

1、本文通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)兩次腹腔注射金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，成功構(gòu)建了二次感染斑馬魚(yú)的淋巴細(xì)胞cDNA的表達(dá)文庫(kù)。對(duì)該文庫(kù)已測(cè)得6988條ESTs序列并拼接成5334clusters，獲得了大量免疫相關(guān)的新基因信息。其間發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)的兩個(gè)死亡受體(ORT和HDR)表達(dá)量較高，這暗示了它們?cè)诙胃腥镜拿庖邞?yīng)答中可能起著很重要的作用。 死亡受體(DeathReceptor，DR)在免疫細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要

2、作用，它們通過(guò)結(jié)合特定的配體和依靠胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域(DeathDomain，DD)介導(dǎo)信號(hào)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們PCR分離并克隆得到斑馬魚(yú)的五個(gè)死亡受體(ORT、DR6、HDR、NGFR和NEW)全長(zhǎng)cDNA序列，將它們預(yù)測(cè)得到的DD與其它物種死亡受體的DD進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)后計(jì)算出的進(jìn)化樹(shù)將這一個(gè)龐大的基因家族按照功能分成了兩大類(lèi)：一類(lèi)是跟介導(dǎo)發(fā)育相關(guān)(DR6和NGFR)；另一類(lèi)是跟免疫反應(yīng)信號(hào)通路相關(guān)(ORT、HDR和NEW)。這為下一步

3、深入研究其功能提供了一定的線索。 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和胚胎整體原位雜交(WISH)等方法對(duì)斑馬魚(yú)五個(gè)死亡受體進(jìn)行了表達(dá)模式的研究分析，得出它們多數(shù)是從胚胎的尾牙期(Budstage)開(kāi)始表達(dá)，HDR和NGFR的表達(dá)在胚胎發(fā)育到12個(gè)體節(jié)(12-somite)才開(kāi)始明顯。ORT、NGFR和NEW廣泛表達(dá)于各個(gè)組織，其中在腎、鰓、腸和腦中表達(dá)量相對(duì)較高，HDR很特異地表達(dá)在成魚(yú)腎臟和靠近生殖腺的間質(zhì)細(xì)胞團(tuán)(in

4、termediatecellmass，ICM)中。而DR6主要表達(dá)在腎、腦、眼等地方，原雜圖片顯示了其在頭腎中特異而且有高量的表達(dá)，由此推測(cè)其功能跟T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)。 通過(guò)分別構(gòu)建金黃色葡萄球菌和殺鮭氣單孢菌(Aeromonassalmonicida)感染斑馬魚(yú)的模型，采用實(shí)時(shí)定量(QuantitativeRealtimePCR)的方法探究了斑馬魚(yú)五個(gè)死亡受體對(duì)在感染狀態(tài)下免疫應(yīng)答的變化。在金黃色葡萄球菌感染模型中，

5、除了NGFR沒(méi)有受影響，其它四個(gè)都有相對(duì)應(yīng)的上調(diào)：ORT在感染4個(gè)小時(shí)上調(diào)9.4倍，HDR在24小時(shí)上調(diào)9倍，DR6在4小時(shí)上調(diào)2.2倍和NEW在24小時(shí)上調(diào)7.4倍；然而在殺鮭氣單孢菌感染模型中，NGFR在感染4小時(shí)后上調(diào)2.8倍，ORT在15小時(shí)上調(diào)了4.2倍，HDR同樣地在24小時(shí)上調(diào)了9.8倍，DR6在15小時(shí)上調(diào)3.5倍，NEW在4小時(shí)上調(diào)3.1倍。 本文還構(gòu)建了斑馬魚(yú)五個(gè)死亡受體的過(guò)表達(dá)融合載體pCMV-DR-GFP

6、和其相對(duì)應(yīng)的缺失死亡結(jié)構(gòu)域的過(guò)表達(dá)載體pCMV-DR(D/N)-GFP，通過(guò)對(duì)老鼠3T3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)這五個(gè)死亡受體的確能在非依賴配體的情況下介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡的信號(hào)。而介導(dǎo)凋亡信號(hào)的關(guān)鍵部位是死亡結(jié)構(gòu)域，剔除掉DD的過(guò)表達(dá)載體喪失了凋亡能力，這個(gè)跟哺乳類(lèi)動(dòng)物的死亡受體一樣。死亡結(jié)構(gòu)域DD的確是在信號(hào)傳導(dǎo)方面發(fā)揮著極其重要的作用。 總之，通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)死亡受體基因功能的初步研究可以加深我們對(duì)該家族在斑馬魚(yú)體內(nèi)所起作用的認(rèn)識(shí)和對(duì)斑馬魚(yú)