核酸探針與核酸酶結(jié)合在分析檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、核酸探針易于合成、穩(wěn)定性好、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、信號(hào)機(jī)制靈活,已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和化學(xué)等領(lǐng)域。核酸探針與核酸酶結(jié)合可以形成多種靈活的分子識(shí)別信號(hào)轉(zhuǎn)換機(jī)制,不僅可以實(shí)現(xiàn)高靈敏、高特異性檢測(cè),還用于生物分子相互作用的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)?；诖?本文把核酸探針與核酸酶相結(jié)合應(yīng)用于分析檢測(cè)中,利用核酸探針靈活的信號(hào)機(jī)制和核酸酶的特異性,具體開(kāi)展了以下3個(gè)方面的工作:
　　 1.基于雙鏈探針和核酸外切酶Ⅰ,發(fā)展了一種放大檢測(cè)小分子的新方法。核酸外

2、切酶Ⅰ只特異性從3’→5’切割DNA單鏈。首先構(gòu)建抗核酸外切酶Ⅰ的核酸適體-cDNA雙鏈探針,當(dāng)有腺苷存在時(shí),通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng),腺苷與核酸適體結(jié)合,雙鏈熒光探針被打開(kāi),核酸外切酶Ⅰ可以水解核酸適體和互補(bǔ)DNA暴露的3’-OH端,釋放出來(lái)的腺苷繼續(xù)結(jié)合另一條核酸適體探針,如此循環(huán),熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)。通過(guò)檢測(cè)酶切反應(yīng)初速度,實(shí)現(xiàn)了小分子腺苷簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)。該方法利用沒(méi)有序列特異性的核酸外切酶Ⅰ進(jìn)行放大,序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單,對(duì)腺苷的檢測(cè)具有良好的特異

3、性和靈敏度,檢測(cè)下限為0.65μM,比傳統(tǒng)核酸適體雙鏈探針?lè)椒ǖ臋z測(cè)下限(26μM)降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí),有望發(fā)展為一種設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、通用的小分子放大檢測(cè)的方法。
　　 2.基于帶AP位點(diǎn)的分子信標(biāo),發(fā)展了一種APE1酶活性分析的新方法。APE1可以切割帶AP位點(diǎn)的DNA。設(shè)計(jì)了兩條分子信標(biāo),一條為臂部雙鏈區(qū)帶有一個(gè)AP位點(diǎn)的長(zhǎng)臂分子信標(biāo)(P1),另一條為環(huán)部單鏈區(qū)帶有一個(gè)AP位點(diǎn)的常規(guī)分子信標(biāo)(P2)。把它們作為APE1酶底物,比較了

4、二者的性能。通過(guò)檢測(cè)酶切初速度,用性能更好的P1探針對(duì)APE1酶活性進(jìn)行了分析。該方法結(jié)合了APE1的特性和分子信標(biāo)靈活的信號(hào)機(jī)制,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單,APE1酶的檢測(cè)下限為0.25 U/mL,線性范圍為0.25-50 U/mL,是一種簡(jiǎn)單的APE1酶活性的分析方法。
　　 3.基于分子信標(biāo)和S1核酸酶發(fā)展了一種檢測(cè)鋅離子的新方法。S1核酸酶是一種單鏈核酸內(nèi)切酶,其酶切速度對(duì)鋅離子有很強(qiáng)的依賴性。使用分子信標(biāo)作為S1核酸酶的底物,通過(guò)檢測(cè)