無標(biāo)記核酸探針的構(gòu)建及其在高靈敏核酸檢測中的應(yīng)用.pdf

1、核酸探針作為現(xiàn)代研究生命科學(xué)的一種基本檢測工具，與一般的檢測方法相比，具有高靈敏度、強穩(wěn)定性、高特異性、易于合成、設(shè)計簡單等優(yōu)點。科研工作者在已經(jīng)研發(fā)出的核酸探針基礎(chǔ)上，不斷開發(fā)出一系列新型核酸探針及其檢測方法，并廣泛應(yīng)用到生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷以及疾病檢測等多個領(lǐng)域?；诖?，本論文基于循環(huán)鏈置換擴增技術(shù)和核酸外切酶Ⅰ，構(gòu)建了新型無標(biāo)記核酸探針，并應(yīng)用于核酸的高靈敏檢測，具體開展了以下三個方面的工作:
　　1、發(fā)展了一種基于聚合酶

2、鏈置換循環(huán)擴增的無標(biāo)記長尾核酸探針體系。在此體系中，核酸探針既可以作為靶分子的識別探針又可以是聚合酶的反應(yīng)模板，并且結(jié)合具有鏈置換活性的聚合酶，設(shè)計簡單、操作簡便，成本低。并且，該體系中無需直接擴增目標(biāo)分子，在等溫條件下實現(xiàn)循環(huán)聚合反應(yīng)，不容易發(fā)生由于外源性污染導(dǎo)致的假陽性反應(yīng)，可以對核酸進行定量檢測分析。
　　2、發(fā)展了一種基于新型核酸探針介導(dǎo)信號放大方法用于高靈敏檢測核酸。新型長尾核酸探針的長尾在引物退火延伸過程中延能長雙鏈D

3、NA產(chǎn)物，嵌入更多的SG熒光染料分子，釋放出強的熒光信號，與循環(huán)擴增反應(yīng)相結(jié)合，提高核酸檢測的靈敏度，檢測下限達到50aM。與分子信標(biāo)探針檢測方法相比，該方法的優(yōu)勢在于不用標(biāo)記，且長尾探針介導(dǎo)的產(chǎn)物能使檢測信號放大，進一步提高核酸檢測的靈敏度。
　　3、發(fā)展了一種基于核酸外切酶Ⅰ的新型核酸探針用于超靈敏檢測DNA或miRNA。核酸外切酶Ⅰ能特異性從3'→5'切割DNA單鏈，當(dāng)沒有靶分子存在時，其能效地從3'-OH端降解探針和引物，