高靈敏熒光各向異性核酸探針的構(gòu)建及其應(yīng)用研究.pdf

1、近年來(lái)，由于核酸分子探針具有設(shè)計(jì)多樣性、靈敏度高和強(qiáng)的定量分析能力等特點(diǎn)，發(fā)展靈敏度高和選擇性好的核酸分子探針成為生物化學(xué)分析領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。熒光各向異性，也被稱(chēng)作熒光偏振，是熒光物質(zhì)的特有屬性，因其快速、精確、靈敏的信號(hào)報(bào)告，使得熒光各向異性檢測(cè)方法廣泛應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建。熒光各向異性檢測(cè)分析法作為一種比值檢測(cè)方法，其值與熒光基團(tuán)的振動(dòng)弛豫時(shí)間密切相關(guān)，而振動(dòng)弛豫時(shí)間與熒光基團(tuán)所結(jié)合分子的分子量或分子體積呈正相關(guān)。熒光各向異性

2、具有抗光漂白以及減小雜散光干擾等能力，其能夠直接用于復(fù)雜生物體系的分析檢測(cè)。隨著科研的不斷發(fā)展，熒光各向異性分析檢測(cè)方法已被廣泛應(yīng)用于蛋白檢測(cè)、藥物篩選、食品分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)及生物化學(xué)研究等領(lǐng)域。然而依靠熒光分子質(zhì)量或體積變化從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)檢測(cè)的傳統(tǒng)熒光各向異性分析法在生物小分子檢測(cè)分析方面存在一定困難。因?yàn)樾》肿幼陨矸肿恿枯^小，與熒光分子結(jié)合之后質(zhì)量變化小，此時(shí)熒光各向異性值變化就很微弱，該報(bào)告信號(hào)很難被檢測(cè)到。為了解決該問(wèn)題，科研工作者

3、引入核酸適配體的應(yīng)用，發(fā)展了一系列基于競(jìng)爭(zhēng)取代機(jī)理、誘導(dǎo)構(gòu)象變化機(jī)理以及質(zhì)量放大策略的核酸熒光各向異性探針用于生物小分子檢測(cè)分析。在本論文中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列新穎的質(zhì)量放大熒光各向異性信號(hào)的核酸探針，并成功應(yīng)用于三磷酸腺苷（ATP）、腺苷、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)等生物小分子檢測(cè)。具體內(nèi)容如下：
　?。?）利用雜交鏈反應(yīng)以及鏈霉親和素的雙重?zé)晒飧飨虍愋孕盘?hào)放大策略，我們提出了一種靈敏高、選擇性好的熒光各向異性核酸探針，

4、并將其應(yīng)用于小分子ATP的檢測(cè)分析，其檢測(cè)下限為100 nM。與單獨(dú)以蛋白質(zhì)作為信號(hào)放大器或單獨(dú)以雜交鏈反應(yīng)作為放大策略進(jìn)行對(duì)比，該實(shí)驗(yàn)的雙重信號(hào)放大策略具有更高的靈敏度。此外，該設(shè)計(jì)探針能夠用于多種復(fù)雜的生物樣品中目標(biāo)小分子ATP的定量檢測(cè)，如在細(xì)胞培養(yǎng)基、人的血清以及人的尿液中，可以檢測(cè)到0.5μM的ATP，初步證實(shí)該探針在實(shí)際生物樣品中的潛在應(yīng)用。（第2章）
　?。?）結(jié)合鏈霉親和素-生物素復(fù)合物和目標(biāo)誘導(dǎo)酶切保護(hù)機(jī)理，我們

5、發(fā)展了一種雙重放大熒光偏振信號(hào)的策略，用于高靈敏地檢測(cè)生物小分子熒光偏振核酸探針的構(gòu)建。與單獨(dú)以目標(biāo)誘導(dǎo)酶切保護(hù)機(jī)理作為放大策略或單獨(dú)以蛋白質(zhì)作為信號(hào)放大器進(jìn)行對(duì)比，該實(shí)驗(yàn)的雙重信號(hào)放大策略具有更高的靈敏度。以腺苷為模型小分子，該策略檢測(cè)下限達(dá)500 nM，其檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于先前報(bào)道的熒光偏振核酸探針。此外，該實(shí)驗(yàn)方法具有普遍性，通過(guò)替換為不同的核酸適配體，可用于相應(yīng)目標(biāo)小分子檢測(cè)。（第3章）
　　（3）利用T4 DNA連接酶對(duì)ATP

6、的高度依賴(lài)性和E.Coli DNA連接酶對(duì)NAD的高度依賴(lài)性，結(jié)合鏈霉親和素-生物素復(fù)合物作為熒光各向異性質(zhì)量放大器，我們發(fā)展了一種簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度、高選擇性的熒光各向異性核酸探針，并將其應(yīng)用于小分子ATP和NAD的檢測(cè)分析。當(dāng)溶液中存在ATP或NAD時(shí)，DNA連接酶發(fā)生連接反應(yīng)，接上質(zhì)量放大部分，從而引起較大的質(zhì)量變化，產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，其中ATP和NAD的檢測(cè)下限分別為50 nM和10 nM，均低于現(xiàn)有的熒光各向異性分析法文獻(xiàn)報(bào)道。