功能核酸探針用于ATP傳感檢測研究.pdf

1、三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP），作為一切生物體新陳代謝的能量物質(zhì)，普遍存在于一切生物細(xì)胞中，為細(xì)胞內(nèi)各種需能過程提供能量，是細(xì)胞生存的必須因素。
　　建立簡單、快速、靈敏和準(zhǔn)確的ATP識(shí)別和檢測方法不僅有助于推動(dòng)生命過程的研究，同時(shí)對(duì)于臨床診斷、藥物分析、藥物開發(fā)等領(lǐng)域也有著重要的實(shí)際意義。核酸探針具有實(shí)時(shí)、快捷、穩(wěn)定、直觀、超靈敏等分析檢測的優(yōu)點(diǎn)。因而在醫(yī)藥、環(huán)境、食品和生命科學(xué)等眾多領(lǐng)域的A

2、TP分析檢測中，具有極其廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用前景。因此，在本論文的研究中，基于比色、熒光和表面增強(qiáng)拉曼光譜分析方法，設(shè)計(jì)了一系列功能化核酸分子探針，構(gòu)建了以下四種ATP的檢測方法：
　?。ㄒ唬┗诿撗鹾嗣福―NAzyme）免標(biāo)記比色法檢測ATP
　?。?）設(shè)計(jì)富含鳥嘌呤堿基（G）的鏈和含ATP適配體的鏈部分互補(bǔ)配對(duì)形成雜交的雙鏈。加入ATP后，ATP與其適配體的鏈形成復(fù)合物，釋放出單鏈形成G-四鏈體引發(fā)顯色反應(yīng)，通過吸光度的

3、變化檢測ATP的含量。
　?。?）利用ATP引發(fā)雙鏈向G-四鏈體的構(gòu)象變化并提高脫氧核酶的催化活性的雙重作用，通過設(shè)計(jì)發(fā)夾型探針，發(fā)展了G-四鏈體脫氧核酶催化顯色檢測ATP的新方法，當(dāng)目標(biāo)物ATP存在時(shí)，發(fā)夾型探針莖部打開，形成了G-四鏈體結(jié)構(gòu)，引發(fā)顯色反應(yīng)，通過吸收信號(hào)的響應(yīng)來檢測 ATP的含量。本探針背景低、靈敏度高、選擇性好,吸光度值與ATP的濃度在0.5至2000μM的范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，檢出限可以達(dá)到0.1μM。而且

4、探針能應(yīng)用于實(shí)際血清樣品的檢測，檢出限為0.5μM。
　?。ǘ┗赟WCNTs富集單鏈DNA原位生長銀納米顆粒SERS檢測ATP
　　發(fā)展了一種靈敏度高、選擇性好、簡便快速的SERS檢測ATP的新方法。ATP的核酸適配體通過生物素親和素共價(jià)交聯(lián)到硅納米微球上，并與其部分互補(bǔ)的短鏈 DNA雜交形成雙鏈DNA。雙鏈DNA具有穩(wěn)定的、剛性的雙螺旋結(jié)構(gòu)，與單壁碳納米管（SWCNTs）作用力弱。加入ATP后，ATP與其適配體結(jié)合形成

5、復(fù)合物通過硅納米微球分離，互補(bǔ)的DNA短鏈富集在SWCNTs上并原位生長銀納米粒子，隨著ATP濃度增大，釋放出的單鏈DNA增多，原位生長的銀納米粒子增多。表面增強(qiáng)拉曼信號(hào)強(qiáng)度在ATP濃度為5-100 nM范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，能應(yīng)用于血清樣品中ATP的檢測，檢出限為10 nM。
　?。ㄈ┝验_型核酸適配體和γ-CD自組裝芘二聚體熒光檢測ATP
　　基于芘二聚體探針的時(shí)間分辨熒光技術(shù)發(fā)展了一種靈敏度高、選擇性好的ATP核酸

6、適配體熒光生物傳感器。標(biāo)記芘分子的兩條裂開的ATP適配體在γ-CD的協(xié)同作用下和ATP結(jié)合，在γ-CD的空腔內(nèi)形成穩(wěn)定的芘二聚體，產(chǎn)生了較強(qiáng)的芘二聚體熒光信號(hào)。時(shí)間分辨熒光測量表明γ-CD的主客體包合作用增加了探針的熒光壽命。該方法對(duì)溶液中ATP的熒光響應(yīng)的信背比為32.1，檢出限為80 nM。采用時(shí)間分辨熒光技術(shù)可以方便地檢測血清中低至0.5μM的ATP。
　　（四）納米火焰型適配體探針熒光共聚焦成像溶酶體中的ATP
　　

7、構(gòu)建了納米火焰型探針應(yīng)用于檢測溶酶體中的ATP。ATP的核酸適配體與其部分互補(bǔ)的標(biāo)記TAMRA的富C的DNA鏈結(jié)合生成雙鏈DNA并通過Au-S鍵連接到金納米顆粒上構(gòu)建納米火焰型探針，在pH為7.4的堿性或中性條件下呈穩(wěn)定的雙鏈構(gòu)象，不能識(shí)別ATP，在pH為4.8的酸性條件下加入ATP后，ATP與其適配體結(jié)合形成復(fù)合物，釋放出的富C的DNA鏈形成了i-motif結(jié)構(gòu)，TAMRA的熒光恢復(fù)。采用金納米顆粒作為分離和內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞的載體，熒光共