基于核酸適配子和DNA芯片的ATP檢測(cè)研究.pdf

1、核酸適配子是人工合成的單鏈寡核苷酸，它能與非核酸靶分子高親和力和高特異性結(jié)合，是從人工構(gòu)建的寡核苷酸文庫(kù)中通過(guò)體外配體指數(shù)級(jí)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出來(lái)的，核酸適配子的功能與抗體相似，但與抗體相比，核酸適配子有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。運(yùn)用SELEX技術(shù)，至今已篩選出針對(duì)不同靶物質(zhì)的核酸適配子。這些核酸適配子在藥物研發(fā)，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究、食品安全衛(wèi)生、臨床治療、疾病的診斷等諸多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。目前，在物質(zhì)檢測(cè)研究中，核酸適配子的應(yīng)用不斷增多，基于核酸

2、適配子物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)不斷更新，它在電化學(xué)阻抗光譜、生物傳感器、分子信標(biāo)、微流控細(xì)胞分離、流式細(xì)胞術(shù)、熒光偏振、組織學(xué)檢查等分析模式中都發(fā)揮著重要的作用。
　　目的:將核酸適配子與DNA芯片技術(shù)、納米金標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建一種高靈敏、高特異的ATP檢測(cè)方法。
　　方法:1.查閱文獻(xiàn)獲得ATP核酸適配子序列，選取ATP核酸適配子作為診斷識(shí)別分子用于ATP的檢測(cè);設(shè)計(jì)與ATP核酸適配子互補(bǔ)的核酸序列作為捕獲探針固定到醛基片上。2.建立

3、并優(yōu)化基于核酸適配子、DNA芯片和納米金標(biāo)記技術(shù)的ATP檢測(cè)方法。優(yōu)化條件包括:捕獲探針固定濃度;生物素修飾的ATP核酸適配子與醛基玻片上的捕獲探針雜交的時(shí)間;ATP與其核酸適配子的反應(yīng)時(shí)間;銀染增強(qiáng)時(shí)間; ATP與其核酸適配子反應(yīng)的pH;ATP與其核酸適配子反應(yīng)的Mg2+離子濃度;3.在優(yōu)化的條件下，分別對(duì)不同濃度的ATP進(jìn)行檢測(cè)以測(cè)定本方法的靈敏度;分別對(duì)ATP、ATP同類和不同類的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)以測(cè)定本方法的特異性。
　　結(jié)果

4、:當(dāng)捕獲探針的濃度為0.6μM時(shí)固定效率達(dá)到最高;在雜交時(shí)間為55min，ATP反應(yīng)時(shí)間為45min，ATP與其核酸適配子反應(yīng)的pH為7.80、Mg+離子濃度為6mM，銀染時(shí)間為5.5min時(shí)該方法的檢測(cè)性能達(dá)到最佳。通過(guò)對(duì)不同濃度的ATP樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該方法在ATP濃度為10-14M到10-9M間時(shí)，ATP濃度的對(duì)數(shù)與灰度值的相對(duì)強(qiáng)度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.996。用該方法對(duì)TTP、UTP、CTP、GTP、BSA和ATP進(jìn)行檢測(cè)