核酸探針用于核酸復(fù)制與酶活性的實時監(jiān)測及點突變分析.pdf

1、核酸的復(fù)制是生命現(xiàn)象中最本質(zhì)的內(nèi)容之一，獲取有關(guān)核酸和聚合酶作用的實時過程信息將有助于DNA復(fù)制過程機理的研究，而且還將為藥物的篩選提供新的技術(shù)手段。傳統(tǒng)的研究DNA復(fù)制過程的分析方法往往采用放射性標記結(jié)合凝膠電泳的方法，無法獲取它們的動力學(xué)過程信息，因此發(fā)展實時的研究DNA復(fù)制過程的分析方法很有意義。 許多疾病如癌癥和遺傳病的發(fā)生都與基因的突變有關(guān)，因此對特定序列DNA的分析以及對DNA鏈中堿基突變的檢測在基因篩選、遺傳疾病的

2、早期診斷和治療方面具有十分重要的意義。發(fā)展簡便、快速、特異的檢測方法用于基因突變研究是非常重要的。 本論文針對上述兩個問題，利用分子信標熒光探針和熒光染料探針，發(fā)展了實時監(jiān)測DNA連續(xù)復(fù)制、聚合酶活性以及基于聚合反應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型方法。主要內(nèi)容包括以下三個方面：1、分子信標體外實時監(jiān)測DNA連續(xù)復(fù)制過程。利用分子信標實現(xiàn)了對DNA連續(xù)復(fù)制過程的實時監(jiān)測，分子信標作為DNA連續(xù)復(fù)制反應(yīng)的模板和檢測分子，實時準確

3、地獲取了DNA連續(xù)復(fù)制過程的信息。與傳統(tǒng)的研究方法相比，該方法避免了放射性同位素標記、變性凝膠電泳、放射性自顯影等復(fù)雜的操作，為DNA連續(xù)復(fù)制過程研究提供了一種新的非同位素分析方法，并在此基礎(chǔ)上建立了快速準確的檢測KlenowFragment(exo-)聚合酶的分析方法。拓展了分子信標用于核酸和蛋白質(zhì)相互作用研究的應(yīng)用領(lǐng)域。 2、發(fā)展了一種簡便快速的聚合酶活性實時檢測新方法。基于雙鏈DNA結(jié)合染料能特異嵌入雙鏈DNA發(fā)出熒光的原

4、理，發(fā)展了一種實時檢測DNA聚合酶活性的簡便方法。在檢測過程中，聚合酶的聚合反應(yīng)進程被實時轉(zhuǎn)換為熒光信號，通過監(jiān)測熒光強度的變化實時檢測聚合酶的活性及藥物對聚合酶活性的影響。該方法不需要對寡核苷酸或dNTP進行放射性同位素標記和熒光標記，也不需要聚丙烯酰胺凝膠電泳和聚合酶鏈式反應(yīng)，是一種簡便、快速價廉的聚合酶活性實時檢測新方法，為研究抗腫瘤藥物對聚合酶活性的影響提供了一種簡捷方法，也將為相關(guān)疾病診治和藥物篩選提供一種新的思路。

5、3、建立了基于等位特異性延伸的SNP基因分型新方法以及用于β地中海貧血點突變的檢測?；趩螇A基變化造成的堿基互補性對引物延伸反應(yīng)的影響，以及染料SYBRGreenI與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)熒光的性質(zhì)來識別有無聚合反應(yīng)，從而達到對SNP位點的分析。該方法實驗設(shè)計簡單，無需合成標記探針，不需要昂貴的實時熒光PCR儀，是一種快速、簡便、經(jīng)濟、特異性好的基因分型方法。運用此方法準確、快速地實現(xiàn)了β地中海貧血遺傳性相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點的基因分型。這