鵝副粘病毒F基因的克隆、分析及核酸探針檢測(cè)方法的建立.pdf

1、鵝副粘病毒病(GooseParamyxoVirusDisease)是由鵝副粘病毒(GooseParamyxoVirus)引起的一種急性、高度接觸性傳染病。該病以腸道糠麩樣潰瘍，胰腺、脾臟腫脹且表面有大小不等的灰白色壞死灶為主要特征。鵝副粘病毒屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亞科，腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)的病毒。由于該病發(fā)病急、致死率高，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，所以被世界衛(wèi)生組織(OIE)列為

2、A類(lèi)烈性傳染病。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)普遍采用接種疫苗為主的鵝副粘病毒病綜合防制措施，使的該病得以控制，但近年來(lái)，該病的流行又呈現(xiàn)出新的特點(diǎn)：高抗體禽群發(fā)生該病，禽1型副粘病毒對(duì)水禽的致病力逐漸增強(qiáng)，水禽(鵝、鴨、企鵝等)不僅是禽1型副粘病毒的宿主和儲(chǔ)存庫(kù)，而且成為禽1型副粘病毒的易感禽類(lèi)。其中鵝的易感性最高，且不同日齡的鵝均易感，日齡越小，發(fā)病率和死亡率越高，半個(gè)月內(nèi)的雛鵝發(fā)病率和死亡率最高，高達(dá)100％。近年來(lái)，該病在我國(guó)呈上升趨勢(shì)，給我國(guó)

3、養(yǎng)鵝業(yè)乃至整個(gè)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 在對(duì)2005年從山東省梁山縣某鵝場(chǎng)分離的一株鵝副粘病毒野毒株(暫名為L(zhǎng)S-1株)進(jìn)行生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上，擴(kuò)增其F基因，并與傳統(tǒng)疫苗株、標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9和已發(fā)表的江蘇分離株進(jìn)行同源性比較、進(jìn)化樹(shù)分析，旨在從分子生物學(xué)水平闡明梁山地區(qū)與其它地區(qū)流行株之間的親緣關(guān)系，為該病的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。本課題分為三部分進(jìn)行研究。 第一部分：鵝副粘病毒LS-1株的分離鑒定及生物學(xué)特性

4、研究該研究從梁山縣一例以腸道糠麩樣潰瘍，胰腺、脾臟腫脹且表面有大小不等的灰白色壞死灶為主要特征的病死鵝中分離到一株病毒，血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)表明該分離株具有血凝性，且其血凝特性能被新城疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清抑制，而不被H9N2亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所抑制。毒力測(cè)定結(jié)果表明該病毒雞肧平均致死亡時(shí)間(MDT)為39.5h；1日齡SPF雞腦內(nèi)接種分離病毒致病指數(shù)為1.76:6周齡SPF雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)為2.42。動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)結(jié)

5、果表明攻毒鵝表現(xiàn)典型的臨床癥狀和病理變化。 第二部分：鵝副粘病毒LS-1株F基因的克隆與序列分析根據(jù)GenBank中已發(fā)表的鵝副粘病毒F基因序列設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異性引物，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出鵝副粘病毒LS-1株F基因全序列，與pMD-18T載體連接后進(jìn)行序列測(cè)定、分析。結(jié)果表明：鵝副粘病毒LS-1株F基因核苷酸長(zhǎng)度為1653bp，編碼551個(gè)氨基酸，有6個(gè)糖基化位點(diǎn)，其裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為112-Arg-Arg-Gln-A

6、rg-Arg-Phe-117，與已發(fā)表的強(qiáng)毒株裂解位點(diǎn)的氨基酸序列相符，從分子水平上表明鵝副粘病毒山東分離株(LS-1)為一強(qiáng)毒株。該毒株F基因與目前已發(fā)表的鵝副粘病毒F基因核苷酸同源性在87.0～98.4％之間，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性在87.0％～98.5％之間；與傳統(tǒng)疫苗株LaSota、強(qiáng)毒株F48E9的核苷酸和氨基酸同源性均分別為84.3％和86.8％。 第三部分：鵝副粘病毒核酸探針檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用根據(jù)GenBank中

7、已發(fā)表的鵝副粘病毒F基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，利用RT-PCR擴(kuò)增出一條與目的片斷大小一致，約856bp的基因片段，回收并純化此PCR產(chǎn)物。用隨機(jī)引物法合成cDNA，用地高辛標(biāo)記，建立鵝副粘病毒核酸探針檢測(cè)方法。該探針能與鵝副粘病毒核酸發(fā)生特異性雜交，而與H9N2亞型禽流感病毒、鵝細(xì)小病毒、大腸桿菌等核酸雜交均為陰性，且最低檢出限量為3pg/μL。疑似病例檢測(cè)結(jié)果表明，氣管、肺臟、脾臟、肝臟均可檢測(cè)出鵝副粘病毒，其中以氣管的檢出率最高