鴨圓環(huán)病毒核酸探針檢測方法的建立及Cap蛋白核定位信號的研究.pdf

1、鴨圓環(huán)病毒（DuCV）是圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus）的新成員。DuCV感染可導(dǎo)致鴨子羽毛凌亂、生長遲緩、體重減輕等癥狀。本研究建立了核酸探針檢測鴨圓環(huán)病毒的方法，并用此方法對鴨圓環(huán)病毒的流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查，同時借助桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對DuCV Cap基因進(jìn)行表達(dá)并對其核定位信號進(jìn)行了研究。
　　 以DuCV傳染性克隆為模板制備了檢測DuCV的核酸探針，研究表明該探針特異性強(qiáng)，只

2、能與DuCV核酸發(fā)生特異性雜交，而與對照的鴨病毒性肝炎Ⅰ型(DHV-1)病毒、鴨瘟病毒(DPV)的核酸雜交反應(yīng)為陰性；靈敏度高，最低檢出量為5pg；使用方便，適合于批量檢測。應(yīng)用該探針對從山東、江蘇、四川等地采集的196只鴨病料，共1025份臟器的組織DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果個體陽性率為33.2％，在各臟器中法氏囊、肝臟、脾臟的DuCV檢出率較高，檢出率分別為52.3％、49.2％、38.5％。
　　 通過PCR方法擴(kuò)增完整的Cap

3、基因，按正確的閱讀框架將其克隆入pFastBac TMHTB 桿狀病毒載體中，將篩選的陽性重組載體pF-CP，轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒穿梭載體和輔助載體的DH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選和PCR 鑒定，獲得重組表達(dá)載體rBacmid-CP。在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Sf9 昆蟲細(xì)胞,72h后獲得重組桿狀病毒。Westernblot和間接免疫熒光（IFA）試驗結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建了表達(dá)鴨圓環(huán)病毒Cap蛋白的重組桿狀病毒，表達(dá)的蛋

4、白與原核表達(dá)Cap蛋白免疫小鼠采集的血清具有良好的反應(yīng)原性。
　　 DuCV FJ0601株Cap蛋白N端存在36個堿性氨基酸（AA），通過軟件PROSITE分析發(fā)現(xiàn)此區(qū)域存在兩個二分裂核定位信號（Bipartite nuclear localization signal），分別位于Cap蛋白N端的第2～17位AA和第21～36位AA。為進(jìn)一步研究鴨圓環(huán)病毒Cap蛋白的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了一系列Cap相關(guān)的融合表達(dá)質(zhì)粒，對其核

5、定位信號區(qū)進(jìn)行了相關(guān)研究。首先將強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）插入pFastBacTM HTB載體，構(gòu)建pF-EGFP重組質(zhì)粒，然后構(gòu)建pF-EGFP-CP、pF-EGFP-CP-Δ17N（N端缺失2-17個AA）和pF-EGFP-CP-Δ36N（N端缺失2-36個AA)三個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Sf9 昆蟲細(xì)胞。結(jié)果顯示pF-EGFP-CP、pF-EGFP-CP-Δ17N蛋白定位在細(xì)胞核中，而pF-EGFP-CP-Δ36N蛋白定位在胞質(zhì)中，這