馬爾尼菲青霉核酸探針的設(shè)計(jì)與應(yīng)用初探.pdf

1、背景和目的: 馬爾尼菲青霉病(Penicilliosis marneffei，P．m)是由致病真菌馬爾尼菲青霉(penicillium marniffei，pm)所引起的一種深部真菌病。青霉廣泛分布于自然界中，已證實(shí)的300余種青霉中，絕大部分是非致病菌，致病菌中以馬爾尼菲青霉的致病性最強(qiáng)。從目前的資料分析，馬爾尼菲青霉病屬地方流行病，好發(fā)于各種原因引起的免疫抑制患者，目前已成為我國(guó)南方和東南亞國(guó)家與地區(qū)AIDS患者常見(jiàn)的繼發(fā)性

2、感染和致死原因。過(guò)去診斷馬爾尼菲青霉菌常常依靠真菌培養(yǎng)，致使診斷延誤，而病理學(xué)診斷又易與組織胞漿菌等巨噬細(xì)胞內(nèi)病原體混淆，因此本研究致力于在前期研究基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)特異性馬爾尼菲青霉核酸探針，以期能夠應(yīng)用原位雜交技術(shù)診斷石蠟組織中的馬爾尼菲青霉菌，以提高臨床診斷效率。 方法: (1)本課題組前期與上海國(guó)家人類(lèi)基因組南方研究中心合作，發(fā)現(xiàn)了pm的可能編碼細(xì)胞壁蛋白的特異性基因PYA 012 92(簡(jiǎn)稱(chēng)92)，通過(guò)生物信息學(xué)方法尋

3、找特異性序列：在NCBI網(wǎng)站上，通過(guò)分析比較PYA92與其他馬爾尼菲青霉序列的同源性，以及PYA92與巨噬細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)主要病原體及真菌進(jìn)行比對(duì)，找出最具保守性的基因，設(shè)計(jì)原位雜交的探針。用PCR方法從pm基因組擴(kuò)增出特定片段，經(jīng)純化、測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，用生物素標(biāo)記擴(kuò)增片段作為原位雜交探針篩選這條基因的特異性序列，以此設(shè)計(jì)探針。 (2)應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性探針，采用原位雜交方法應(yīng)用于己明確診斷為pm和其它深部真菌病的石蠟組織切片上，驗(yàn)證該

4、探針的特異性、靈敏度。 結(jié)果: 對(duì)已經(jīng)培養(yǎng)和病理證實(shí)的23例馬爾尼菲青霉病組織，以及23例其它真菌(其中曲菌14例、白色念珠菌4例、新型隱球菌2例、毛霉菌3例)感染病例的石蠟組織切片進(jìn)行DNA原位雜交，驗(yàn)證設(shè)計(jì)探針的敏感性和特異性：23例馬爾尼菲青霉病組織中全部真菌均可顯示，敏感性為100％，所有組織切片中的人體組織成分、以及23例其它真菌均為陰性，特異性為100％，該法與金標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)和病理學(xué)診斷的符合率為100％。初步