曲霉和馬爾尼菲氏青霉多糖蛋白檢測(cè)方法的研究.pdf

1、背景及目的：
　　 侵襲性真菌感染是因機(jī)體免疫力下降引發(fā)的嚴(yán)重的播散性真菌感染。近30年來(lái)，隨著繼發(fā)性免疫功能低下(如白細(xì)胞減少癥、燒傷、器官移植、HIV感染等)人群的增多、免疫抑制劑、抗腫瘤藥物及廣譜抗生素的大量使用、導(dǎo)管置管的廣泛開展等，機(jī)會(huì)性真菌感染呈明顯的上升趨勢(shì)，較為突出的有2種真菌：曲霉(Aspergillus spp.)和馬爾尼菲氏青霉(Penicillium marneffei)。發(fā)病率主要與病人的免疫力狀態(tài)和暴

2、露于危險(xiǎn)因素(如環(huán)境中高濃度的真菌污染等)的程度有關(guān)。曲霉廣泛分布于環(huán)境中，種類繁多，有200種左右，是家居環(huán)境和糧食、食品中最常見的污染真菌，嚴(yán)重影響人類健康。其中10種以上可以引起人類疾病，常見為煙曲霉和黃曲霉，少見的有土曲霉、黑曲霉和構(gòu)巢曲霉等，臨床上表現(xiàn)為過(guò)敏性疾病和致死性的侵襲性曲霉病。而青霉中唯一的溫度依賴性雙相真菌--馬爾尼菲氏青霉，主要引起AIDS患者和免疫力低下人群的感染。自1956年分離于越南的竹鼠以來(lái)，在東南亞國(guó)家

3、如泰國(guó)、印度北部、我國(guó)南方省份(如廣東、廣西、香港、臺(tái)灣)、越南等感染病例的報(bào)道逐年增加，呈明顯地域性，尤其在HIV感染高發(fā)區(qū)，馬爾尼菲氏青霉的感染率也明顯升高。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，馬爾尼菲氏青霉已經(jīng)成為東南亞國(guó)家AIDS患者中并發(fā)機(jī)會(huì)性感染的主要致病菌之一。上述兩種真菌所導(dǎo)致的侵襲性感染，如侵襲性曲霉病和播散性馬爾尼菲氏青霉病，病情急重，死亡率極高，據(jù)報(bào)道已經(jīng)超過(guò)50％，主要原因是：(1)缺乏早期、準(zhǔn)確的診斷；(2)抗真菌藥物的毒副作用

4、嚴(yán)重且耐藥株不斷增多。
　　 為降低感染病人的死亡率，迅速、快捷、準(zhǔn)確的診斷對(duì)預(yù)后尤為重要。但系統(tǒng)性的機(jī)會(huì)性真菌感染多發(fā)生于免疫功能嚴(yán)重受損的病人，缺乏特異性臨床表現(xiàn)，因此，須依賴實(shí)驗(yàn)室手段進(jìn)行確診。目前實(shí)驗(yàn)室診斷真菌感染的方法主要有：真菌培養(yǎng)、分子生物學(xué)技術(shù)、組織學(xué)檢查和血清學(xué)診斷。(1)真菌培養(yǎng)是真菌感染實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是耗時(shí)長(zhǎng)，周期一般4周左右。(2)雖然分子生物學(xué)方法更靈敏快速，但是需要特殊的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備和操作技

5、術(shù)，并較易發(fā)生污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；而且環(huán)境中廣泛存在的曲霉也為分子生物學(xué)檢測(cè)增加了難度。(3)組織學(xué)檢查雖然快速，但對(duì)免疫功能嚴(yán)重受損的患者而言創(chuàng)傷性極大。(4)血清學(xué)診斷則成為早期診斷真菌感染的一種合理選擇。但是，由于曲霉廣泛存在于周圍環(huán)境中，每人每天至少吸入幾百個(gè)漂浮于空氣中的曲霉孢子，幾乎每個(gè)健康成年人血清中均含有較高濃度的曲霉特異性抗體；血清中抗體的檢測(cè)還受限于患者在嚴(yán)重免疫抑制狀態(tài)下，無(wú)法產(chǎn)生足夠的抗體。所以，特異性抗體檢測(cè)對(duì)

6、曲霉感染的早期診斷意義不大。雖然部分馬爾尼菲氏青霉感染患者中存在特異性抗體，但研究發(fā)現(xiàn)特異性抗體的檢出率并不高，而且在伴有馬爾尼菲氏青霉感染的AIDS患者中，特異性抗原升高的水平較抗體更明顯。因此，尋找特異性抗原，尤其是循環(huán)抗原，將有助于曲霉及馬爾尼菲氏青霉感染的早期診斷，并可能用于HIV感染的輔助診斷。
　　 目前真菌感染早期診斷的靶標(biāo)集中在真菌細(xì)胞壁成分，尤其是多糖成分。多糖(或多糖蛋白)是構(gòu)成真菌細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，也是細(xì)胞

7、壁上的主要抗原成分，其中甘露聚糖(或甘露聚糖蛋白)含量最高。有研究發(fā)現(xiàn)曲霉病人血清中存在高水平的循環(huán)半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)，并以此為靶標(biāo)建立的雙夾心曲霉抗原檢測(cè)試劑盒(Platelia Aspergillus)，在曲霉病的早期診斷中有重要價(jià)值。但檢測(cè)青霉素類抗生素(例如：氨芐西林-舒巴坦，哌拉西林-三唑巴坦，阿莫西林-克拉維酸)治療的免疫抑制病人標(biāo)本時(shí)，該試劑盒的假陽(yáng)性率很高，這是由于GM抗原還同時(shí)存在于其它真

8、菌如青霉細(xì)胞壁中，從而導(dǎo)致臨床誤診，進(jìn)行不必要的抗真菌治療。而馬爾尼菲氏青霉感染卻缺乏特異、靈敏的早期診斷試劑盒。因此，本研究旨在建立一種能夠特異性檢測(cè)并區(qū)分曲霉和馬爾尼菲氏青霉感染的免疫學(xué)方法。
　　 方法及結(jié)果：
　　 本研究主要包括三部分內(nèi)容：
　　 第一部分：曲霉屬和煙曲霉特異性多糖蛋白檢測(cè)方法的研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期研究用煙曲霉提取曲霉多糖蛋白和特異性位于煙曲霉細(xì)胞壁和分泌上清中的重組甘露聚

9、糖蛋白(命名為Afmplp)，分別免疫小鼠并制備針對(duì)曲霉多糖蛋白的單克隆抗體和針對(duì)Afmplp的單克隆抗體，分別以這兩組單抗配對(duì)建立兩種雙抗體夾心ELISA抗原捕獲法。本研究進(jìn)一步探討這兩種檢測(cè)方法對(duì)曲霉多糖蛋白的特異性和廣譜性。用這兩種曲霉多糖蛋白檢測(cè)方法對(duì)多種環(huán)境曲霉和臨床曲霉培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用煙曲霉提取多糖蛋白免疫制備單抗建立的檢測(cè)方法可廣譜性檢測(cè)臨床、環(huán)境中的多種曲霉；而煙曲霉Afmplp單抗建立的檢測(cè)方法僅特異性檢

10、測(cè)臨床和環(huán)境中的煙曲霉。且這兩種檢測(cè)方法與其它真菌(1株馬爾尼菲氏青霉及5株念珠菌)均無(wú)交叉反應(yīng)，提示兩種方法分別為曲霉屬?gòu)V譜性和煙曲霉特異性檢測(cè)方法。
　　 上述結(jié)果表明，這兩種檢測(cè)方法除可用于早期診斷曲霉感染，特別是煙曲霉感染，還可用于廣譜檢測(cè)污染環(huán)境、農(nóng)作物、食品中的多種曲霉，為早期診斷曲霉病和監(jiān)測(cè)環(huán)境、農(nóng)作物、食品中的曲霉污染提供新的技術(shù)手段。
　　 第二部分：馬爾尼菲氏青霉多糖蛋白單克隆抗體和免疫兔血清的制備及

11、鑒定。
　　 研究初步證實(shí)甘露聚糖蛋白也存在于馬爾尼菲氏青霉感染患者血清中，因此可以作為早期診斷的靶標(biāo)。本研究用一種從馬爾尼菲氏青霉cDNA文庫(kù)中克隆的甘露聚糖蛋白(命名為Mplp)為免疫原，通過(guò)畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)該重組Mplp多糖蛋白并免疫小鼠，取抗體效價(jià)高的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)重組Mplp蛋白和間接免疫熒光法篩選強(qiáng)陽(yáng)性克隆，最終獲得18株穩(wěn)定分泌Mplp蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。免疫球蛋白亞類鑒定18株單克

12、隆抗體，10株為IgG1，3株為IgG2a，3株為IgG2b，2株為IgG。采用相互競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)分析單克隆抗體識(shí)別抗原表位，結(jié)果顯示18株單克隆抗體至少識(shí)別4個(gè)不同的抗原位點(diǎn)。
　　 同時(shí)用Mplp重組多糖蛋白免疫新西蘭大白兔，獲得了高效價(jià)免疫兔血清，抗體滴度達(dá)到1×10-7血清稀釋度。免疫印跡和間接免疫熒光鑒定18株單克隆抗體和免疫兔血清，顯示：18株單克隆抗體和免疫兔血清均僅與馬爾尼菲氏青霉酵母相細(xì)胞產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，但不結(jié)合菌

13、絲相細(xì)胞；與環(huán)境中常見的其它3種青霉及4種臨床曲霉均無(wú)交叉反應(yīng)。
　　 通過(guò)對(duì)18株針對(duì)Mplp單克隆抗體和免疫兔血清免疫學(xué)特性的研究、抗體識(shí)別抗原位點(diǎn)的分析以及特異性的鑒定，其結(jié)果顯示這組抗體可用于建立馬爾尼菲氏青霉抗原檢測(cè)方法。
　　 第三部分：馬爾尼菲氏青霉多糖蛋白檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化。
　　 采用雙抗體夾心ELISA法，根據(jù)單克隆抗體識(shí)別不同的抗原表位，18株單克隆抗體和兔多抗之間進(jìn)行互相配對(duì)，通過(guò)檢測(cè)馬

14、爾尼菲氏青霉培養(yǎng)上清、超聲上清及重組Mplp多糖蛋白的靈敏度和特異性，經(jīng)反復(fù)多次篩選，最終確定了以單克隆抗體IF53A7和3C10A9-Biotin組合用于構(gòu)建檢測(cè)方法。經(jīng)方陣滴定法確定，包被抗體濃度為10μg/ml，生物素標(biāo)記抗體工作濃度為1:500。建立的雙抗體夾心抗原捕獲法檢測(cè)重組Mplp蛋白的靈敏度為31pg/ml。用該方法進(jìn)一步檢測(cè)其它青霉培養(yǎng)上清，結(jié)果均為陰性。
　　 以上結(jié)果表明，采用抗體夾心抗原捕獲法建立的Mpl

15、p多糖蛋白檢測(cè)方法具有很高的靈敏性和特異性，可為馬爾尼菲氏青霉感染提供一種新的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。
　　 結(jié)論：
　　 綜合以上三部分的研究結(jié)果，本研究的結(jié)論如下：
　　 一、利用兩組單克隆抗體成功建立可分別特異性檢測(cè)煙曲霉和廣譜檢測(cè)曲霉屬的免疫學(xué)方法，為曲霉病早期診斷和環(huán)境、農(nóng)作物、食品中污染曲霉的監(jiān)測(cè)提供新的技術(shù)手段。
　　 二、成功制備了多株具有馬爾尼菲氏青霉酵母相細(xì)胞抗原特異性的單克隆抗體，為免疫診斷

16、試劑的研制、馬爾尼菲氏青霉多糖蛋白生物學(xué)特性的研究以及開發(fā)馬爾尼菲氏青霉治療性抗體等奠定基礎(chǔ)。
　　 三、率先建立靈敏度高、特異性強(qiáng)的雙單克隆抗體夾心馬爾尼菲氏青霉多糖蛋白捕獲ELISA法，該方法特異性針對(duì)馬爾尼菲氏青霉酵母相細(xì)胞抗原，與其它青霉及曲霉均無(wú)交叉，有望用于馬爾尼菲氏青霉感染的早期診斷。
　　 四、利用甘露聚糖蛋白為靶標(biāo)，成功的建立了區(qū)別檢測(cè)曲霉和馬爾尼菲氏青霉的方法，為特異性診斷曲霉和馬爾尼菲氏青霉感染奠定