馬爾尼菲青霉氟康唑耐藥機制的研究.pdf

1、目的:氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)LC)是我國臨床上治療馬爾尼菲青霉（Penicillium marneffei，PM）感染的常用抗真菌藥物，但臨床療效欠佳，體外藥敏示MIC值較高，考慮部分PM存在FLC耐藥的可能。本研究擬探討PM FLC耐藥與唑類藥物靶酶基因及藥物流出泵基因表達和功能的關(guān)系，了解PM對FLC不敏感的分子機制。
　　方法:實驗菌株包括2株FLC臨床治療抵抗、體外藥敏提示FLC MIC較高的PM臨床耐藥株A1

2、、A3;以PM標準株FRR2161為母本，通過在含F(xiàn)LC濃度≥64μg/ml培養(yǎng)基上誘導獲得的6株P(guān)M誘導株C2、C3、C4、B3、B4、B5;以及標準株FRR2161。在此基礎(chǔ)上，課題組進行了以下研究:(1)參照美國臨床和實驗室標準化研究所(clinical and laboratory standardinstitute，CLSI)的M38-A2方案并作適當修改，采用微量稀釋法測定實驗菌株對兩性霉素B(amphotericin B，

3、AmB)、FLC、伊曲康唑(itraconazole，ITC)、伏立康唑(voriconazole，VOC)敏感性，并借鑒白念珠菌FLC藥敏判斷標準建立PM FLC藥敏標準;(2)在25℃時FLC耐藥株與標準株進行比較，觀察實驗菌株的表型特征、生長速率及產(chǎn)孢率;(3)做銅圈小培養(yǎng)，觀察25℃時實驗菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu);(4)提取標準株及FLC耐藥株的DNA，測定實驗菌株的ITS(Internal Transcribed Spacer)區(qū)序列，

4、進行比對;(5)對實驗菌株用4種隨機引物P23、P103、P105、P120進行隨機擴增多態(tài)性分析（Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）;(6)對實驗菌株的唑類藥物靶酶基因cyp51B進行測序，并與GenBank中公布的PM基因cyp51B序列進行比對;(7)提取實驗菌株的RNA，用realtime PCR分別測定各菌株中唑類藥物靶酶基因cyp51B及相關(guān)藥物流出泵基因的相對表達量。(8)所得

5、數(shù)據(jù)通過軟件SPSS16.0采用獨立樣本t檢驗進行比較，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:(1)建立PM FLC藥敏標準:選取FLC MIC值2.0～8.0μg/ml敏感，16～32μg/ml劑量依賴性敏感，大于或等于64μg/ml判斷為耐藥。實驗菌株除標準株FRR2161外，余菌株FLC MIC值范圍為128～256μg/ml，符合FLC耐藥判斷標準;實驗菌株均對AmB、ITC以及VOC敏感;(2)25℃時PM FLC耐藥株

6、與標準株FRR2161相比，生長速率下降(P＜0.05);(3)25℃銅圈小培養(yǎng)實驗示PM FLC耐藥株產(chǎn)分生孢子數(shù)相對標準株FRR2161降低;(4)PM FLC耐藥株和標準株FRR2161與GenBank上公布的PM ITS區(qū)序列完全一致;(5)RAPD實驗中，PM FLC誘導耐藥株與其母本標準株FRR2161比較，用4種隨機引物進行擴增，所得產(chǎn)物帶型完全一致，但其帶型與PM FLC臨床耐藥株明顯不同;(6)實驗菌株存在藥物靶酶基因

7、cyp51B不同堿基位點的突變，而造成相應(yīng)氨基酸的替換:菌株C2、C4的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)有T1583C的點突變，導致14α脫甲基酶第440位的絡(luò)氨酸被組氨酸替代(Y440H);菌株B4、B5的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)有G1587T的點突變，導致14α脫甲基酶第441位的甘氨酸被纈氨酸替代(G441V);菌株A1的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)有T1618C的點突變，但14α脫甲基酶沒有氨基酸的替換;菌株A3的靶酶基因cyp51B

8、編碼區(qū)有G1587A、T1618C的點突變，導致14α脫甲基酶第441位的甘氨酸被天冬氨酸替代(G441D);菌株C3、B3的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)未見點突變。(7)PM FLC耐藥株與標準株FRR2161比較，藥物排出泵基因AtrF、Mdr1、PMFCZ表達量增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而靶酶基因cyp51B、藥物排出泵基因ABC和MFS表達量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:體外誘導PM FLC耐藥