不同生存環(huán)境對馬爾尼菲青霉乙醛酸循環(huán)的影響及其意義的研究.pdf

1、研究目的: 1.觀察溫度、葡萄糖濃度、一氧化氮對馬爾尼菲青霉的生長及其乙醛酸循環(huán)、糖異生、糖酵解代謝過程的影響。 2.觀察巨噬細胞內微環(huán)境變化對馬爾尼菲青霉的生長及其乙醛酸循環(huán)、糖異生、糖酵解代謝過程的影響。 3.探討乙醛酸循環(huán)在馬爾尼菲青霉致病中的作用。 實驗對象和方法: 1.馬爾尼菲青霉菌絲相、酵母相及分生孢子的獲?。厚R爾尼菲青霉SUMS0152株，接種于裝有20ml沙堡弱葡萄糖液體培養(yǎng)基的搖

2、瓶中，25℃150 r/min振蕩孵育72h，離心收集菌絲體；接種于腦心浸汁(BHI)固體培養(yǎng)基上，每3天傳代1次，數(shù)次傳代后，至鏡下觀察基本為酵母相細胞時，再接種于裝有20ml BHI液體培養(yǎng)基的搖瓶中，37℃150 r/min振蕩孵育72h，離心收集酵母相細胞；將馬爾尼菲青霉接種于PDA培養(yǎng)基，25℃孵育14d，用無菌生理鹽水沖洗培養(yǎng)基表面，過濾去除菌絲，離心收取分生孢子。 2.實驗分組： 第一類分組：分為4組，每組

3、4個樣本。菌絲相含糖培養(yǎng)組(MG)將菌絲懸于20m10.17﹪YNB+2﹪葡萄糖的培養(yǎng)基中；菌絲相無糖培養(yǎng)組(MN)將菌絲懸于20ml 0.17﹪YNB+2﹪乙酸鹽的培養(yǎng)基中，兩組均25℃150 r/min振蕩孵育12h。酵母相含糖培養(yǎng)組(YG)將酵母細胞懸于20m10.17﹪YNB+2﹪葡萄糖的培養(yǎng)基中；酵母相無糖培養(yǎng)組(YN)將酵母細胞懸于20ml 0.17﹪’YNB+2﹪乙酸鹽的培養(yǎng)基中，兩組均37℃ 150 r/min振蕩孵育1

4、2h。以上述各組培養(yǎng)基加入1.5﹪瓊脂制成相應的固體培養(yǎng)基，接種P.m分生孢子，觀察菌落生長情況；以改良SDA、BHI接種P.m分生孢子，25℃、37℃觀察菌落生長情況。 第二類分組：馬爾尼菲青霉酵母細胞按接種的培養(yǎng)基(pH5)分組，高糖(1﹪葡萄糖)培養(yǎng)基中按加入0mM、1mM、2mM、3mM的NaNO<,2>分為H0、H1、H2、H3共4組；低糖(0.1﹪葡萄糖)培養(yǎng)基中按加入0mM、1mM、2mM、3mM的NaNO<,2>

5、分為L0、L1、L2、L3共4組，每組各4個樣本。 第三類分組：分為4組，每組4個樣本。0組將馬爾尼菲青霉接種于DMEM(0.45﹪葡萄糖)細胞培養(yǎng)基中，37℃ 150rpm孵育48h；1組將馬爾尼菲青霉分生孢子與RAW264.7細胞(小鼠單核巨噬細胞系)共培養(yǎng)于DMEM細胞培養(yǎng)基中，37℃5﹪CO<,2>的溫箱中孵育6h，棄去細胞外馬爾尼菲青霉繼續(xù)孵育48h；2組在1組的基礎上，于培養(yǎng)體系中加入rMulFN-γ和LPS以刺激R

6、AW264.7細胞;3組在2組的基礎上，于培養(yǎng)體系中加入一氧化氮合酶抑制劑LNMMA。1、2、3組棄去細胞外馬爾尼菲青霉，獲取細胞內馬爾尼菲青霉作為樣本。 3.熒光定量RT-PCR檢測： 提取各實驗組馬爾尼菲青霉樣本的總RNA，反轉錄獲得cDNA，采用各自的特異性引物進行real-time PCR，分析各組馬爾尼菲青霉ICL1、PCKl、PFK2的基因相對轉錄水平。 4.ICL1酶活性檢測： 采用玻璃珠破

7、壁獲取馬爾尼菲青霉具有活性的總蛋白，加入異檸檬酸37℃孵育1h，加入6.4M鹽酸胍終止反應后再加入2-硝基苯酸，室溫反應10min，采用分光光度計檢測最終產物硝基苯酸的A<,412>值，以校正的A<,412>值反映ICL1蛋白的量及活性。 5.NO含量檢測： 按照NO檢測試劑盒說明書操作，取細胞培養(yǎng)上清液、20 μ mol/L亞硝酸鈉標準液、蒸餾水各1ml，加入反應試劑一0.8ml、試劑二0.4ml，混勻后，放置10mi

8、n，4000rpm離心10min，取澄清上清液0.8ml，加入顯色劑0.4ml，混勻，15min后在550nm檢測吸光度OD值，根據公式計算NO含量。 6.馬爾尼菲青霉生長情況的比較： 固體培養(yǎng)基上采用菌落直徑進行比較。液體培養(yǎng)基中馬爾尼菲青霉酵母細胞懸液經50W超聲波處理3min后，采用DU70分光光度儀檢測340nm吸光度，比較A<,340>值。巨噬細胞內馬爾尼菲青霉采用菌落計數(shù)進行比較。 7.統(tǒng)計學處理：

9、 正態(tài)分布計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩因素單獨效應、主效應及交互效應采用2×2析因分析；非正態(tài)分布計量資料組間比較采用秩和檢驗，兩變量相關關系采用Spearman等級相關分析。采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包處理實驗數(shù)據，顯著性水準α設為0.05。 結果: 1.溫度、葡萄糖濃度對馬爾尼菲青霉生長及乙醛酸循環(huán)的影響相同葡萄糖濃度下，菌絲相較酵母相生長更迅速(p<0.05)；隨著葡萄糖濃度降低，

10、菌絲相和酵母相生長速度均下降(p<0.05)，但酵母相生長速度下降幅度較小。 2.一氧化氮對馬爾尼菲青霉生長及乙醛酸循環(huán)的影響一氧化氮對馬爾尼菲青霉酵母相ICL1、PCK1、PFK2的轉錄及ICL1的蛋白表達和活性具有明顯抑制作用，隨著一氧化氮濃度上升，抑制作用增強(p<0.01)。低糖相對于高糖對ICL1轉錄及其蛋白表達和活性具有誘導效應，隨著一氧化氮濃度上升，該誘導效應明顯減弱(p<0.01)。 一氧化氮對低糖和高糖

11、培養(yǎng)基中的馬爾尼菲青霉的生長均有抑制作用，并且隨一氧化氮濃度上升抑制作用增強(P<0.01)。隨著一氧化氮濃度上升，低糖組相對于高糖組的存活率也明顯下降(P<0.01)。低糖對ICL1轉錄水平的誘導效應，與馬爾尼菲青霉的低糖存活率呈正相關(r<,s>=0.99，P<0.01)。 3.巨噬細胞內微環(huán)境對馬爾尼菲青霉生長及乙醛酸循環(huán)的影響ICL1、PCK1轉錄水平及ICL1的蛋白表達和活性，均顯示為3組>2組>1組>0組(0組為細胞

12、外，1組為細胞內，2組為活化的細胞內，3組為活化但不能產生NO的細胞內)，各組間差異有統(tǒng)計學意義。PFK2轉錄水平顯示0組>1組>3組>2組，僅2組與其他組差異有統(tǒng)計學意義。 經IFN-γ、LPS刺激的RAW264.7細胞產生的活性氮成分明顯增加(P<0.01)，對細胞內馬爾尼菲青霉生長有明顯抑制作用(P<0.01)。抑制活性氮成分的產生，可恢復馬爾尼菲青霉的生長。 結論: 1.首次設計相關引物，采用熒光定量RT

13、-PCR檢測了馬爾尼菲青霉ICL1、PCK1、PFK2的轉錄水平，各產物均為單一片段，符合檢測標準。 2.建立了小鼠巨噬細胞系吞噬馬爾尼菲青霉的共培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)未經IFN γ等刺激的巨噬細胞產生微量的NO，不能有效地殺滅P.m；經IFN γ等刺激的巨噬細胞產生較大量的NO，可明顯殺滅P.m；刺激后加入NOS抑制劑的巨噬細胞產生NO明顯減少，對P.m殺滅作用減弱；共培養(yǎng)體系可很好地模擬正常宿主或免疫缺陷宿主巨噬細胞與P.m的相互作

14、用。 3.37℃生長和葡萄糖缺乏的環(huán)境均可誘導乙醛酸循環(huán)、糖異生代謝加強，使碳源向葡萄糖方向流動，兩因素的誘導作用具有協(xié)同效應。在葡萄糖缺乏的環(huán)境中，馬爾尼菲青霉酵母相的乙醛酸循環(huán)、糖異生較菌絲相更為活躍，使其酵母相細胞更能耐受低糖的微環(huán)境。 4.NO抑制乙醛酸循環(huán)、糖異生、糖酵解，抑制P.m酵母相細胞生長，抑制作用隨NO濃度上升而增強。NO對低糖環(huán)境下P.m酵母相細胞生長的抑制作用更明顯，說明NO可在一定程度上通過抑制

15、乙醛酸循環(huán)來殺滅馬爾尼菲青霉酵母相細胞。 5.在未經IFN γ刺激的巨噬細胞內，馬爾尼菲青霉乙醛酸循環(huán)、糖異生代謝加強，P.m能繼續(xù)生存；在經：IFN γ刺激但不能產生足夠NO的巨噬細胞內，P.m乙醛酸循環(huán)、糖異生代謝進一步加強，P.m仍能生存：在經IFN γ刺激產生足夠NO的巨噬細胞內，P.m乙醛酸循環(huán)、糖異生代謝被抑制，P.m被大量殺滅。P.m在巨噬細胞內的生存既與其乙醛酸循環(huán)的活性明顯相關，也取決于巨噬細胞的功能狀態(tài)。乙醛

16、酸循環(huán)在P.m致病過程中起著重要作用，同時宿主的免疫功能也是發(fā)病與否的關鍵因素。 6.馬爾尼菲青霉ICL1的表達可能存在多途徑、多層次的調控；ICL1與其它可能的致病因子之間是否存在相互調節(jié)的網絡，目前也不甚清楚。所以下一步研究計劃包括：1)對馬爾尼菲青霉ICL1蛋白表達的具體調節(jié)過程和機制進行深入研究；2)篩選馬爾尼菲青霉ICL1基因及其它基因缺陷株，進一步尋找馬爾尼菲青霉的致病因子，并探討這些致病因子間的相互關系?；谝陨涎?/p>