生物功能化粒子-核酸探針技術快速檢測病原菌及ATP的研究.pdf

1、病原菌引起的感染性疾病是近年威脅人類健康和造成社會恐慌的主要因素,同時也是造成人類死亡的重要原因。檢測任務的緊迫性與檢測樣品的復雜性給傳統(tǒng)病原菌檢測方法提出了嚴峻的挑戰(zhàn),而傳統(tǒng)的檢測方法由于在特異性、靈敏度、操作簡便性、快捷性等方面存在缺陷,難以滿足日益發(fā)展的病原菌快速檢測的需要。因此發(fā)展病原菌的快速、靈敏和準確的檢測方法具有十分重要的意義。納米材料有著獨特的表面效應、小尺寸效應、量子尺寸效應和宏觀隧道效應,在其表面進行各種修飾獲得的各

2、種功能化納米材料與傳統(tǒng)檢測方法相結合,衍生出具有高通量、高靈敏、快速檢測的方法;核酸探針技術是目前分子生物學中應用最廣泛的技術之一,是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列的有力工具。本論文以三種納米粒子和核酸探針技術為基礎,結合新型的檢測工具,發(fā)展了新的靈敏度高、特異性好的病原菌及ATP分子檢測技術。
　　 本論文主要包括以下幾個研究內容:
　　 (1)構建了基于免疫磁珠(Immunomolecular magnetic

3、 beads,IMBs)/表面等離子共振技術(surface plasmon resonance,SPR)的G群鏈球菌(Group G Streptococcus,GGS)快速分離檢測體系。首先通過磁珠(magnetic beads,MBs)表面的不同功能基團與抗體分子共價結合得到三種功能化IMBs。實驗考察了三種MBs與抗體的結合能力,結果表明三種磁珠均能很好地結合抗體分子,醛基化的磁珠結合能力最佳;實驗還針對免疫磁珠分離鏈球菌的效果

4、進行了考察,結果也表明三種免疫磁珠都能特異地分離樣品中GGS,分離效果亦以醛基化的免疫磁珠效果最好。為了對IMBs分離的GGS進行定量分析,本研究聯(lián)合了SPR技術?；诳贵w分子與GGS的相互作用,在數(shù)十分鐘內可以對菌濃度處于1.0×107CFU/ml-1.0×108CFU/ml范圍內的GGS進行實時快速檢測。與其它傳統(tǒng)分離方法相比,本研究所采取的分離方法要簡便和快速得多,能在一小時之內快速地分離得到目標菌。
　　 (2)基于核酸

5、適配體-ATP復合物與綠色熒光染料Eva GreenTM作用,建立了熒光信號檢測腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine-triphosphate,ATP)新方法。體系優(yōu)化了核酸適配體與ATP結合反應的實驗條件。實驗結果表明,核酸適配體與ATP反應的最適溫度為12℃;pH值為7.5時,熒光檢測結果最靈敏;在最優(yōu)化的實驗條件下,隨著ATP濃度的減小,所測得的熒光信號與空白對照的變化值變小。由檢測結果可知,當ATP濃度從10-6mol/L到10

6、-2mol/L變化,對應的熒光強度隨著濃度的減小而增大,呈現(xiàn)一定的線性關系。因此可作為該范圍濃度的ATP定量檢測的依據(jù)。體系還對該方法的特異性作出了探討,將ATP同類型分子CTP、GTP、UTP作為對照,根據(jù)檢測出的結果可知該核酸適配體對與ATP分子的檢測具有較強的特異性。相較于其他的檢測方法,本研究所建立的基于核酸適配體-ATP特異識別的熒光檢測技術,對于ATP分子的檢測,不僅反應體系特異性高,并且實驗操作簡單,耗時少,成本低?？梢?

7、本研究為之后的分子識別和檢測提供了更為堅實的基礎。
　　 (3)利用量子點(QD)與金黃色葡萄球菌特異性序列制備了一種功能化QD-DNA探針,基于此探針熒光能量共振轉移,建立了一種用于高效檢測金黃色葡萄球菌16s rDNA的方法。本研究詳細研究了氨基修飾的DNA與羧基修飾的QD不同比值、不同靶序列濃度等條件對熒光強度與熒光能量共振轉移效率的影響,實驗結果表明,熒光強度在羧基修飾的QD與氨基修飾的DNA比值為1:80時達到最大值,

8、熒光能量共振轉移效率在靶序列為60nM時趨向于穩(wěn)定并在80nM時效率最高。在最佳實驗條件下,檢測系統(tǒng)最低可檢測至20nM的金黃色葡萄球菌16s rDNA序列,其靈敏度已達到熒光標記的分子信標、DNA傳感器、電化學線性探針等方法檢測下限。實驗結果亦證實該方法具有較強特異性?？傊?此方法具有操作簡單、耗時較短、靈敏度及特異性較強等特點,為金黃色葡萄球菌的檢測開辟了一條新的道路。
　　 (4)以核酸適配子與配體的特異性識別為基礎,以金