納米磁珠與PCR聯(lián)合技術(shù)在玉米病原菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、植物病原細(xì)菌是一類(lèi)危害性極大的病原生物，可引起廣泛傳播，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。玉米細(xì)菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii subsp. stewartii, pstew）和玉米內(nèi)州萎蔫病菌（Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis, cmn）能引起玉米作物的毀滅性的病害，其中 pste w在美國(guó)，加拿大,墨西哥、越南、泰國(guó)等國(guó)家均有報(bào)道，c mn因首次爆發(fā)于美國(guó)內(nèi)州而得名，我國(guó)目

2、前尚未見(jiàn)病原菌爆發(fā)的報(bào)道。二者的傳播方式主要有種媒和蟲(chóng)媒兩種傳播途徑，而且我國(guó)每年都要從國(guó)外進(jìn)口大量的玉米種子，因此對(duì)玉米種子進(jìn)行有效快捷的病原菌檢疫尤為重要。
　　植物病原細(xì)菌的口岸檢疫要求簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，技術(shù)要求比較高，其檢測(cè)手段一直是口岸植物檢疫的難點(diǎn)。因此，有效控制細(xì)菌病害的入侵主要是提高口岸病原菌的檢測(cè)技術(shù)水平，研究出一種簡(jiǎn)便快速且高靈敏度的檢測(cè)方法十分重要。
　　采用化學(xué)共沉淀等方法合成了納米裸磁珠和表面修飾的

3、納米磁珠，并通過(guò) TEM和DLS測(cè)試對(duì)合成磁珠進(jìn)行表征分析。采用PCR16S rDNA擴(kuò)增和測(cè)序?qū)τ衩准?xì)菌性枯萎病菌和玉米內(nèi)州萎蔫病菌進(jìn)行初步鑒定。將磁珠和菌液共同孵育，通過(guò)磁珠與菌液非特異性結(jié)合的方式，選擇吸附性能最佳的磁珠，優(yōu)化孵育反應(yīng)的條件，比如孵育溫度，時(shí)間，磁珠用量等，確定最佳孵育條件。在最佳條件下，磁珠和菌液孵育，進(jìn)行菌體結(jié)合和濃縮，磁場(chǎng)分離后，利用特異性引物，通過(guò)PCR方法，對(duì)目標(biāo)菌特異性檢測(cè)。本文還使用掃描電鏡對(duì)兩種病原

4、菌的形態(tài)學(xué)進(jìn)行了觀察。通過(guò)透明圈抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)磁珠對(duì)目標(biāo)菌的毒性作用。
　　通過(guò)DLS測(cè)得的Zeta電位表明，合成的納米磁珠表面帶有不同的電荷，其中表面修飾 PDDA的帶有正電荷，共沉淀法合成的裸磁珠，表面帶有負(fù)電荷，表面修飾有PSS及-COOH，帶有很強(qiáng)的負(fù)電荷。而且合成磁珠的粒徑大小從20 nm到500 nm不等。PCR16S rDNA擴(kuò)增和測(cè)序比對(duì)證實(shí)，所用引物正確，能夠?qū)崿F(xiàn)菌株的特異性檢測(cè)。將四種磁珠和菌液孵育后，初步分析磁

5、珠和菌結(jié)合的原因，發(fā)現(xiàn)表面帶正電荷的磁珠與菌有最大的結(jié)合。磁珠大小和形狀等也對(duì)磁珠與菌的結(jié)合有一定的影響，但因本文采用磁珠的電荷差異較大，故無(wú)法分析磁珠粒徑對(duì)磁珠與菌結(jié)合的影響。吸附率與磁珠的用量成正相關(guān)，在磁珠濃度為4 mg/mL的時(shí)候達(dá)到平衡。溫度對(duì)吸附率的影響不大，室溫下即可，這與目標(biāo)菌的最適生長(zhǎng)溫度為24～28℃一致。孵育時(shí)間對(duì)吸附率的影響較大，其中玉米細(xì)菌性枯萎病菌與磁珠孵育40 min達(dá)到飽和，而玉米內(nèi)州萎蔫病菌與磁珠孵育2