三重PCR檢測雞肉中常見病原菌的研究.pdf

1、食品安全問題一直是一個世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生安全問題。近年來，食品安全事件頻發(fā)，食品安全問題引起了國際社會的廣泛關注。致病菌污染是導致食源性疾病感染的主要因素，加強食品中致病菌的檢驗力度是解決這一問題的最有效的途徑。目前，國內(nèi)檢測食品中致病菌主要采用傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)、生化鑒定的方法，其操作繁瑣，檢測時間較長，通常需要一周才能完成，且靈敏度較低，已經(jīng)不能滿足食品中致病菌快速靈敏檢測的需要。PCR檢測方法具有高效、低成本、高靈敏度等優(yōu)點，但是

2、普通PCR每次只能檢測一種或一類致病菌，一旦檢測方向有誤就會造成時間和藥品浪費。多重PCR與普通PCR原理相同，但能同時檢測多種食源性致病菌，彌補了普通PCR的缺點，節(jié)省了成本和時間，作為一種快速、高效且高通量的檢測方法在在致病菌檢測領域有著廣泛的發(fā)展空間。
　　 多重PCR是一種在同一反應體系中加入針對多個靶基因分別設計的一對特異性引物，同時擴增出多條目的基因片段的擴增方法。本文以編碼小腸耶爾森氏菌黏附侵襲的ail基因、大腸桿

3、菌O157∶H7基因組中的ECs3032序列和沙門氏菌的invA基因，分別設計一對特異性引物進行PCR擴增，實現(xiàn)對三種食源性致病菌的檢測。再利用正交試驗方法設計L16(44)正交表，對影響多重PCR反應的四個關鍵因素進行初步優(yōu)化，再采用固定其他因素改變單一因素的方法進一步進行優(yōu)化，確定多重PCR反應最終體系為25μL:10×PCRbuffer2.5μL，Mg2+(50mmol/L)、dNTPs(各2.5mmol/L)各2.0μL，模板各

4、1.5μL，上下游引物(10μmol/L)各1.5μL，0.4μ.LTaq酶(5U/μL)，加滅菌蒸餾水補足25μL;多重PCR擴增程序為:多重PCR反應采用冷啟動，預變性94℃5min;變性94℃1min、退火54.1℃1min、延伸72℃2min，共進行30個循環(huán);72℃延伸10min，反應產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。
　　 進行引物特異性和反應特異性試驗，證明該方法具有較好的特異性。擴增產(chǎn)物進行

5、測序，并將測序結(jié)果在GenBank上進行在線BLAST比對，以驗證方法特異性。證實了擴增產(chǎn)物與目的基因同源性分別為99.15％、99.71％、97.61％。在最佳實驗條件下，多重PCR同時檢測三種食源性致病菌純培養(yǎng)物的靈敏度均為103CFU/mL;采用試劑盒法提取DNA，人工污染雞肉樣品經(jīng)9h富集培養(yǎng)增菌后，三種致病菌在雞肉中的最低檢出限沙門氏菌和大腸桿菌O157∶H7為103CFU/mL，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌可達到102CFU/mL，