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文檔簡介
1、菌血癥及腸道感染是臨床常見的感染性疾病。其涉及的病原菌范圍廣泛,種類繁多。在患者自身免疫力降低,或者得不到及時正確處理時,病情加劇可發(fā)展為敗血癥伴發(fā)休克癥狀。因此,快速準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌對指導(dǎo)臨床治療十分重要。而常規(guī)的病原學(xué)診斷方法包括標(biāo)本中細(xì)菌培養(yǎng)、分離及生化反應(yīng)鑒定,所需時間長,難以及時指導(dǎo)疾病的治療?;蛐酒夹g(shù)的發(fā)展對于醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及感染性疾病的診治而言意義深遠(yuǎn),是查明感染性疾病病原體的強(qiáng)有力工具。本課題研究目的是為了建立一種適合在
2、普通臨床診斷實驗室開展的高效、簡單、成本較低的病原菌高通量芯片檢測分析系統(tǒng)。以往應(yīng)用16SrRNA基因檢測細(xì)菌較多,近年來的研究表明核糖體大亞基RNA(23SrRNA)基因序列在種水平比16SrRNA基因具有更多的可變位點,分辨率高。故我們以23SrRNA基因為靶分子建立菌血癥常見病原菌懸浮芯片檢測分析系統(tǒng)。研究結(jié)果顯示,此靶分子不足以區(qū)分鑒定某些腸桿菌科細(xì)菌,因此選擇蛋白編碼基因gyrB分析腸道感染病原菌。為了明確gyrB基因?qū)τ谀c道
3、感染常見的腸桿菌科與弧菌科細(xì)菌是否具有良好的區(qū)分鑒別能力,我們對所獲得的臨床分離株gyrB基因序列進(jìn)行了詳細(xì)的系統(tǒng)發(fā)育分析,為研發(fā)基于gyrB基因的腸道感染常見病原菌懸浮芯片檢測系統(tǒng)提供客觀依據(jù)。 第一部分菌血癥常見病原菌懸浮芯片高通量檢測研究 基因芯片檢測細(xì)菌時,先使用通用引物實現(xiàn)對不同細(xì)菌相對保守的DNA區(qū)域的普遍擴(kuò)增,然后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上的探針發(fā)生雜交反應(yīng),各種PCR產(chǎn)物依其序列與探針的異同而產(chǎn)生雜交信號的有
4、無及強(qiáng)弱差異,因而,可以利用這些特異性的信號差異來區(qū)分鑒別病原菌。依據(jù)基因芯片支持物的不同,可將其分為固相芯片與懸浮芯片。固相芯片以玻片或者膜為載體;懸浮芯片以微球為載體,雜交反應(yīng)于液相環(huán)境中進(jìn)行。后者較前者具有顯著的優(yōu)點,如價格低,芯片制備方便、靈活性強(qiáng)及儀器操作簡單等,目前已開始在科研和臨床應(yīng)用中嶄露頭角。本研究選擇23SrRNA基因為靶分子,采用懸浮芯片系統(tǒng)檢測菌血癥常見病原菌。檢測分析了91株細(xì)菌,涉及28個菌種,為懸浮芯片鑒定
5、大范圍菌種提供客觀依據(jù)。 30個寡核苷酸探針與不同微球集共價偶聯(lián),并按一定方式混合后制成懸浮芯片。待測菌株23SrRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與此芯片中的寡核苷酸探針發(fā)生雜交反應(yīng)形成DNA二聚體,加入熒光素標(biāo)記的報告分子,使之與上述DNA二聚體結(jié)合,經(jīng)LiquiChip檢測器(LiquiChipReader)讀取待測菌株反應(yīng)體系內(nèi)每個探針的雜交反應(yīng)信號,經(jīng)2~4重復(fù)實驗后,獲得待測菌株的寡核苷酸探針雜交模式。 研究結(jié)果顯示,
6、多數(shù)臨床分離株獲得的寡核苷酸探針雜交模式具有菌種特異性,可依據(jù)此模式區(qū)分鑒別細(xì)菌。其中革蘭氏陰性菌包括:嗜水氣單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、弗氏檸檬酸桿菌、流感嗜血桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、鼠傷寒沙門菌;革蘭氏陽性菌包括:糞腸球菌、屎腸球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌。另外,還有一些細(xì)菌不能通過雜交模式而相互區(qū)別,包括三組:①奇異變形桿菌與普通變形桿菌;②6種凝固酶陰性葡萄球菌與表皮葡萄球菌
7、;③肺炎鏈球菌與綠色鏈球菌。由于同一菌種內(nèi)存在多個雜交模式而非理想的唯一的特異性模式,一些產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌臨床分離株因雜交模式一致而不能區(qū)分。因此,對于這些不能區(qū)分鑒別的菌種我們還需要分析更多的菌株以明確其所產(chǎn)生的寡核苷酸探針雜交信號有無差異及差異有無顯著性,同時需要設(shè)計更多的探針以擴(kuò)大菌種鑒定范圍,避免錯誤鑒定。 本研究為懸浮芯片系統(tǒng)應(yīng)用于大范圍臨床分離菌株區(qū)分檢測提供了客觀依據(jù)。針對目前芯片的不
8、足之處,可以充分利用懸浮芯片自身靈活性較高的特點,在后續(xù)工作中通過增加或者刪減微球集而篩選特異性高的寡核苷酸探針以擴(kuò)大菌種鑒定范圍,改進(jìn)與提高芯片系統(tǒng)。 第二部分基于gyrB基因分類鑒別腸道病原菌 中國常見的腸道細(xì)菌感染,主要由志賀菌屬、沙門菌屬、致病性大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌等所致。鑒于本文第一部分的結(jié)果來看,23SrRNA基因分辨率有限不足以區(qū)分其中幾種腸桿菌科臨床分離株。近年來,已有一些研究利用分辨率較高
9、的蛋白編碼基因gyrB分類鑒別密切相關(guān)的菌種。GyrB基因是單拷貝基因,普遍存在于各種細(xì)菌中,編碼DNA促旋酶(DNAgyrase)的B亞單位,具ATP酶活性。DNA促旋酶為一種細(xì)菌中的Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶(TypeⅡDNAtopoisomerases),在DNA復(fù)制及DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的維持過程中起著重要的作用。以蛋白編碼基因作為鑒定的靶基因,其核苷酸序列較高的變異率不但是更高分辨率的保證,也對特異性探針的設(shè)計提出了更高的要求。只有在合適的大
10、樣本量序列數(shù)據(jù)庫支持下,對可變位點進(jìn)行有效判斷分析才能獲得特異性高的探針。據(jù)此,我們測序了2科8屬14種腸道感染常見病原菌,其中臨床株有101株,獲得了腸道感染病原菌的該基因部分序列,為分析中國腸道感染病原菌臨床株提供了一份寶貴數(shù)據(jù)。以此數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),我們采用系統(tǒng)發(fā)育分析方法,全面評估gyrB基因潛在的分辨力(鑒別能力)。詳述如下: 聯(lián)合對位排列分析gyrB基因序列數(shù)據(jù)集后,使用PHYLIP軟件,以三種方法:距離法(distanc
11、e-method,Neighbour-Joining,NJ聚類)、最大簡約法(Maximum-Parsimony,MP)、最大似然法(Maximum-Likelyhood,ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,每種方法均進(jìn)行2000次自舉(bootstrap)檢驗。同時,為明確所分析的序列內(nèi)是否存在核苷酸替代飽和現(xiàn)象,而采用DAMBE軟件對gyrB序列數(shù)據(jù)進(jìn)行測試,結(jié)果僅密碼子第三位核苷酸發(fā)生替代飽和現(xiàn)象。為排除其對構(gòu)建反應(yīng)真實進(jìn)行過程的系統(tǒng)發(fā)育樹的影
12、響,我們分析了GyrB氨基酸序列,同樣使用PHYLIP軟件,以NJ聚類法與MP法構(gòu)樹,并進(jìn)行2000次自舉檢驗。 此外,為了便于同傳統(tǒng)表型方法相比較,依據(jù)第九版伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊,選定了38個生化指標(biāo)做為性狀特征,自定義性狀打分值并據(jù)此建立距離矩陣,再采用NJ法與算術(shù)平均的無權(quán)重配對聚類法(Unweighted-PairGroupMethodwithArithmeticmeans,UPGMA)構(gòu)建表型樹。比較分析各菌株在基因系統(tǒng)
13、發(fā)育樹及表型樹中的聚類關(guān)系。 考慮到DNA促旋酶是喹諾酮類藥物的作用靶點,為防止菌株相關(guān)耐藥突變掩蓋真實種系發(fā)生關(guān)系。我們對一部分所用臨床分離株進(jìn)行了多種喹諾酮類藥物耐藥測試。 三種方法(NJ,MP與ML)所得的核苷酸樹的大體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),在種屬水平幾乎完全一致。其差異主要集中在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌及類志賀鄰單胞菌聚類的具體位置。所分析的序列,除了志賀菌、大腸桿菌與氣單胞菌外,屬于同一菌種的不同菌株都聚類在一起形成單系類群,并
14、且每群都有較高的自舉支持率。NJ與MP法所得的氨基酸樹中,大腸桿菌與志賀菌、陰溝腸桿菌、沙門菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌形成一自舉支持率較高的單系類群;類志賀鄰單胞菌與腸桿菌科細(xì)菌聚類。表型系統(tǒng)發(fā)育樹有兩個較大的分枝:弧菌科與腸桿菌科細(xì)菌;類志賀鄰單胞菌與腸桿菌科聚類。 基于三種不同運算方法的系統(tǒng)發(fā)育分析闡明了gyrB基因序列可以在科、屬、種、甚至種內(nèi)血清型不同層面區(qū)分鑒別腸道感染常見病原菌,特別是在種水平顯示了較好的分辨率。核苷酸序
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